HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2在稽留流产患者绒毛组织中的表达

王 玲，赵卫东

HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2在稽留流产患者绒毛组织中的表达

王 玲1，2，赵卫东1

目的探讨低氧诱导因子（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）及VEGF受体（VEGFR-1、VEGFR-2）在稽留流产（MA）绒毛组织中的表达及临床意义，探究MA发生中低氧对脑血管生成的影响。方法免疫组化SP法检测35例MA患者（研究组）以及32例正常早孕行人工流产者（对照组）绒毛组织的HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的表达水平，并对结果进行统计分析。结果研究组与对照组绒毛组织中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2均有表达。研究组中HIF-1α表达高于对照组（P＜0.05），VEGF、VEGFR-2表达明显低于对照组（P＜0.05）。对照组中HIF-1α与VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2表达呈正相关性（P＜0.05），研究组中HIF-1α与VEGF、VEGFR-2表达呈负相关性（P＜0.05），与VEGFR-1表达无相关性。结论 HIF-1α在MA绒毛组织中表达上升，通过调节VEGF、VEGFR-2基因的转录，胎盘绒毛血管的生成减少，可能是MA发生的重要原因。

稽留流产；低氧诱导因子；血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体

稽留流产（missed abortion，MA）也称过期流产，是指妊娠20周之前胚胎或胎儿已死亡滞留宫腔内未能及时自然排出，是自然流产的一种特殊类型。引起MA的原因众多，但确切机制尚不明确。在早期妊娠中绒毛膜的绒毛血管化与胚胎发育密切相关，在此过程中血管的缺陷会导致一些并发症。在妊娠早期，胚胎的发育和胎盘的形成是在一个相对低氧的情况下完成的，低氧对滋养层细胞相关的侵袭和分化过程起重要的调节作用［1］。许多调节因子如低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、VEGF受体（vascular endotheli-al growth factor receptor-1、2，VEGFR-1、VEGFR-2）与早孕胎盘血管的生成和发展关系密切。该研究检测MA患者绒毛组织中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2分子的表达情况及相互关系，从血管生成的角度对MA的发生进行研究。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取2013年6月～2013年12月在安徽省妇幼保健院妇科住院的MA患者35例为研究组，孕妇年龄20～35（29.40±4.52）岁，孕周7～10（8.40±2.34）周。筛选标准：①年龄20～35岁，胚胎停止发育的时间在停经7～10周；②TORCH检测、抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody，ACA）、抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）、抗子宫内膜抗体（endomethal antibody，ENA）检测均为阴性；③本次妊娠期间未服用保胎药物，无毒物接触史；④无原发性高血压、糖尿病、慢性肾炎、甲状腺功能亢进等病史；⑤宫颈分泌物检查支原体、衣原体为阴性。纳入标准：经B超及β-hCG动态监测证实为MA。选取因非意愿妊娠在本院门诊要求行人工流产的早孕妇女32例为对照组，孕妇年龄21～36（28.30±5.53）岁，孕周7～10（7.90±2.16）周。筛选标准：月经规律，获取标本前3个月未使用过甾体类激素，无异常孕育史，无原发性高血压、糖尿病、慢性肾炎、甲状腺功能亢进等病史。纳入标准：经B超检查提示其为宫内妊娠，可见胚胎心管搏动，但其要求行“人工流产”的健康孕妇。两组患者的年龄、孕产次差异无统计学意义。本研究经研究对象知情同意并签字。

1.2 标本的采集及处理在无菌条件下采用负压（53.3～66.7 kPa）抽吸方法吸出的绒毛组织，迅速在生理盐水中漂洗后，放入10%甲醛固定液固定24 h，石蜡包埋，制成4 μm厚连续切片，黏附于防脱腊的载波片。按试剂盒说明书检测HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的表达。常规HE染色法观察两组绒毛及血管形态。

1.3 免疫组织化学检测方法采用免疫组化SP法，按照试剂盒说明书操作。采用辣根酶标记链酶卵白素免疫组化法。4 μm厚切片，60℃烤箱过夜后脱蜡至水，酒精梯度脱水后蒸馏水洗；加入柠檬酸抗原高压修复，高压锅冒汽后2 min，室温冷却，3%的过氧化氢溶液封闭10 min；加一抗抗体，4℃冰箱过夜，PBS冲洗；加生物素标记的二抗，PBS冲洗；加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，PBS冲洗。DAB显色，苏木精复染，脱水透明，中性树脂封片。用PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.4 实验试剂兔抗人单克隆抗体HIF-1α、兔抗人单克隆抗体VEGF、兔抗人单克隆抗体VEGFR-2原液、三部法免疫组化试剂均购自北京中杉金桥公司；兔多克隆抗体VEGFR-1原液购自武汉博士德公司。

1.5 结果判定每张切片随机选取5个视野（× 400），镜下见黄色颗粒为阳性细胞，阳性产物应分布于细胞质。依照细胞阳性着色程度（抗原含量）可分为：无着色（0分），淡黄色颗粒（1分），浅褐色颗粒（2分），深褐色颗粒（3分）。着色细胞数以每张切片阳性细胞占细胞总数的百分比表示：没有阳性细胞（0分），＜10%（1分），11%～50%（2分），51%～80%（3分），＞80%（4分）。采用积分综合计量，计算公式为：总数值＝着色强度×着色细胞数；整个得分从0～12分，根据最终得分结果分为3个等级：0分，无反应；1～4分，低表达；＞4分，高表达。至少随机观察5～10个高倍镜视野［2］。

1.6 统计学处理应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法分析，计量资料同一因子组间的比较采用两组独立样本的t检验分析，蛋白表达相关性分析采用Spearman秩相关方法，使用GraphPad Prism 5.0软件绘制相关统计图。

2 结果

2.1 研究组与对照组临床特征χ2检验和Fisher确切概率法分析两组患者年龄、孕周差异无统计学意义。研究组阴道流血明显多于对照组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。研究组既往有妊娠史多于对照组，组间比较差异无统计学意义。见表1。

表1 临床特征

2.2 两组绒毛组织中HIF-1α与VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表达情况采用t检验分析表达情况，HIF-1α在两组绒毛细胞滋养细胞、合体滋养细胞的细胞质和细胞核、血管内皮细胞周围的间质细胞质中均有表达，在研究组表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。VEGF、VEGFR-2在两组绒毛细胞滋养细胞、合体滋养细胞、血管内皮细胞及周围间质细胞质中均有表达，在研究组中明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。VEGFR-1在两组绒毛细胞滋养细胞、合体滋养细胞质中均有表达，两组中表达差异无统计学意义。见图1、2，表2。

2.3 HIF-1α与VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2表达的相关性采用Spearman秩相关方法分析相关性，对照组中HIF-1α与VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表达呈正相关性（P＜0.05）。研究组中HIF-1α与VEGFR-2呈负相关性（P＜0.05），与VEGFR-1无明显相关性。见表3、4。

表2 两组中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表达比较（±s）

表2 两组中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表达比较（±s）

因子对照组（n＝32）研究组（n＝35）t值P值HIF-1α2.57±0.423.57±0.852.160.043 VEGF6.14±0.713.14±1.182.470.019 VEGFR-12.24±0.402.31±0.270.930.360 VEGFR-24.04±0.501.85±0.393.180.003

表3 对照组中HIF-1α与VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表达相关性分析

3 讨论

HIF是一种异质二聚体蛋白，由α亚基和β亚基构成。HIF-1α常氧条件下经过泛素蛋白水解途径降解，低氧环境下其降解过程受抑制，HIF-1α蛋白迅速累积，并与HIF-1β聚合，形成有活性的HIF-1蛋白，调节其靶基因的转录［3］。HIF-1α特异性作用于低氧反应通路，调节活性。研究［4］表明HIF-1α可以通过诱导血管生成而发挥作用。本研究显示在研究组及对照组绒毛组织中HIF-1α均有表达，提示早孕低氧下HIF-1α发挥了重要作用。研究［5］表明，HIF-1α上升引起滋养细胞分化为侵入型受抑制，滋养细胞侵入子宫螺旋动脉变浅，胎盘血管灌注减少引起妊娠失败。本研究表明HIF-1α在MA中表达上升，可能与MA中严重低氧诱导HIF-1α有关。

表4 研究组中HIF-1α与VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表达相关性分析

VEGF被认为是最强大的血管生成启动子，VEGFR-1、VEGFR-2是VEGF的两个高亲和力受体；VEGFR-2是血管生成主要因子，与VEGF结合后发挥促进血管生成的作用。研究［6］显示，敲除VEGFR-1基因的小鼠胚胎，内皮细胞过度增生，血管官腔阻塞，形成过多无功能血管，胚胎死亡，提示VEGFR-1具有负性调节作用。早孕时血管生成的正负因子处于平衡状态，这个平衡促进血管的生成并维持正常的妊娠。妊娠早期胎盘血管的形成在VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2的指导下进行［7］，研究［8］也表明早孕胎盘绒毛中VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2在血管生成中起作用。本研究中研究组和对照组绒毛组织中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2都有表达，且研究组中的VEGF、VEGFR-2表达明显低于对照组，提示MA中血管生成的正性因子受到抑制，负性因子无明显改变，导致胎盘血管生成减少引起妊娠失败。研究［9］表明，MA中VEGF、VEGFR-2表达明显下降。

本研究中对照组绒毛组织中HIF-1α与VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2呈正相关性，表明低氧通过HIF-1α上调VEGF表达，胎盘绒毛血管网络逐渐形成并促进妊娠的继续。研究组中HIF-1α与VEGF、VEGFR-2呈负相关性，与VEGFR-1无明显的相关性。研究［10］表明，MA中HIF-1α表达上升，VEGF下降，HIF-1α与VEGF呈负相关性，这与本研究结果一致。为VEGF引起MA的关键作用的假设提供了支持。推测在MA这个严重低氧的环境下，HIF-1α表达上升，HIF-1α可能抑制了VEGF的表达，血管生成的平衡被打破，正性因子减少，负性因子无明显改变，胎盘绒毛血管生成减少，早期胚胎不能获得足够的氧气和营养物质，导致MA的发生。

综上所述，低氧程度不同造成HIF-1α、VEGF、 VEGFR-1、VEGFR-2之间关系失衡引起血管发育的异常可能是造成MA的重要原因。MA中HIF-1α引起VEGF、VEGFR-2升高的具体机制有待进一步研究，明确MA病因并尽早诊断治疗。

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The expression and significance of HIF-1α，VEGF，VEGFR-1 and VEGFR-2 in missed abortion patients

Wang Ling1，2，Zhao Weidong1
（1Dept of Obstetrics and Gynaecology，The Affiliated Provincial Hosptial of Anhui Medical University，Hefei 230001；2Dept of Obstetrics，Anhui Province Maternity and Child Care，Hefei 230001）

ObjectiveTo study the expressions and clinical significance of hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α），vascular endothelial growth factor（VEGF），vascular endothelial growth factor receptor-1（VEGFR-1）and vascular endothelial growth factor receptor-2（VEGFR-2）in the villi tissue of patients with missed abortion（MA）and early pregnant women.To explore the influence of hypoxia on placenta angiogenesis in missed abortion.MethodsTo detect the expression of HIF-1α，VEGF，VEGFR-1 and VEGFR-2 in the villi tissue of 35 cases of MA patients（research group）and 32 early pregnant women（control group）who underwent induced abortion surgery by immunohistochemistry，and theResultswere statistical analysis.ResultsHIF-1α，VEGF，VEGFR-1 and VEGFR-2 were expressed both in the villi tissue of research group and the control group.The expression of HIF-1α was higher in the research group than in the control group（P＜0.05）.The expressions of VEGF，VEGFR-2 were significantly lower in the research group than in the control group（P＜0.05）；the expression of HIF-1α was positively correlated with VEGF，VEGFR-1and VEGFR-2 in the control group，and the expression of HIF-1α was negatively correlated with VEGF and VEGFR-2 in the research group（P＜0.05），which had no correlation with VEGFR-1.ConclusionThe expression of HIF-1α in the villi tissue of MA is up-regulated，the blood vessel formation of placenta decreases by adjusting the VEGF and VEGFR-2 genes transcription，which maybe is the important causes for MA.

HIF-1α；VEGF；VEGFR-1；VEGFR-2；missed abortion

R 714.21

1000－1492（2015）02－0227－05

2014－11－13接收

安徽省科技攻关计划项目（编号：08010302101）

1安徽医科大学附属省立医院妇产科，合肥 2300012安徽省妇幼保健院产科，合肥 230001

王 玲，女，硕士研究生；赵卫东，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：victorzhao＠163.com