呼吸道肺炎克雷伯菌耐药性与CTX-M型ESBLs的研究*

钟如柱,许志明，喻云梅，刘 军，赵祖国

(1.广东省廉江市人民医院呼吸内科 524400；2.广东医学院病原生物学实验室，广东湛江 524023)

论著·临床研究

呼吸道肺炎克雷伯菌耐药性与CTX-M型ESBLs的研究*

钟如柱1,许志明1，喻云梅2，刘 军2，赵祖国2

(1.广东省廉江市人民医院呼吸内科 524400；2.广东医学院病原生物学实验室，广东湛江 524023)

目的探讨来源于呼吸道肺炎克雷伯菌(KP)耐药性与CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的关系。方法采用PCR扩增和测序分析检测KP质粒和染色体上的CTX-M型ESBLs基因；采用纸片扩散法检测抗菌药物敏感性；使用χ2检验分析相关数据。结果有CTX-M-1群酶和CTX-M-25群酶检出，CTX-M型ESBLs的总检出率为39.02%(48株)，其中质粒和染色体上同时携带CTX-M-1群酶的检出率为26.02%(32株)。β-内酰胺类抗菌药物头孢唑林、氟喹诺酮类抗菌药物左旋氧氟沙星、磺胺类抗菌药物复方磺胺甲恶唑等在CTX-M型ESBLs阳性组的耐药率明显高于阴性组(P<0.05)。结论在来源于呼吸道的KP中，在质粒和染色体上同时携带CTX-M-1群酶基因最常见，CTX-M型ESBLs与KP对某些抗菌药物产生耐药性关系密切。

呼吸道感染；肺炎克雷伯菌；超广谱β-内酰胺酶

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KP)是引起呼吸道感染常见的革兰阴性杆菌，根据全国细菌耐药监测网统计，KP的检出率在肠杆菌科细菌中排列第2，仅次于大肠埃希菌，其对多种抗菌药物表现耐药[1]。非透射电镜(TEM)型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和非SHV 型ESBLs起源的CTX-M型ESBLs，是我国目前最常见、最主要的ESBLs，常见的亚群有CTX-M-1 群、CTX-M-2 群、CTX-M-8群、CTX-M-9群和CTX-M-25群，是造成KP对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药的重要原因[2-3]。值得的注意的是，CTX-M型ESBLs在各地区的携带率、种类、位置等均不一致，为了解本地区引起呼吸道感染的KP的耐药性与CTX-M型ESBLs的关系，本研究通过检测CTX-M型ESBLs在来源于呼吸道KP质粒和染色体上的流行现状和KP的耐药性，探讨CTX-M型ESBLs与KP耐药性的关系，为治疗KP引起的呼吸道感染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 123株非重复KP 来源于2013年10月至2014年10月广东省廉江市人民医院和广东医学院第二附属医院临床送检的痰标本，其中肺源性KP 54株；抗菌药物敏感性试验的质控株大肠埃希菌ATCC25922和各类CTX-M型ESBLs阳性株均由广东医学院病原生物学实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 染色体和质粒DNA的制备 采用ESBLs检测试剂盒检测KP的产ESBLs情况，试剂盒购自杭州天和微生物试剂公司。参考文献[4]，采用变温十二烷基硫酸钠(SDS)消除法消除产ESBLs株的质粒后(确认消除效果：质粒抽提，电泳检测消除结果)，采用基因组提取试剂盒提取细菌染色体DNA，质粒DNA直接采用质粒提取试剂盒提取，试剂盒均购自大连宝生物有限公司，并用核酸蛋白检测仪(BECHMA，DU730)检

表1 用于扩增CTX-M型ESBLs基因的引物

1.2.2 CTX-M基因的检测 根据GenBank中的所提供的序列，运用oligo及premier5.0软件设计各类CTX-M型ESBLs的特异引物，并由上海生工合成。分别以质粒DNA和染色体DNA为模板，PCR检测质粒和染色体上的各类CTX-M型ESBLs基因，PCR试剂盒购自大连宝生物有限公司。引物序列等情况见表1。

1.2.3 TA克隆、转化及DNA系列分析 挑选目的PCR产物，采用PCR产物快速回收试剂盒(大连宝生物有限公司)纯化PCR产物，随后采用超级感受态细菌制备试剂盒(碧云天生物技术研究所)进行制备感受态细菌(DH5α大肠埃希菌)。载体为PMDTM18-T载体(大连宝生物有限公司)，严格按照相关试剂盒说明书操作，并把菌液送上海生工测序。利用 Chromas软件，把所测的结果与GeneBank数据库进行比对分析，以确定耐药基因类型。

1.2.4 抗菌药物敏感性试验 采用纸片扩散法测定123株KP对14种临床常用抗菌药物的敏感性。试验结果判断参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)的标准[5]，各种抗菌药物纸片等购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件分析数据，计数资料以率表示，采用χ2检验分析相关数据，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CTX-M型ESBLs基因的检测结果 产ESBLs株共57株(46.34%)，CTX-M型ESBLs基因的检出率为39.02%(48株)，占ESBLs阳性的84.21%(48/57)，其中CTX-M-1型ESBLs的检出率为38.21%(47株)，CTX-M-25型ESBLs的检出率为3.25%(4株)，CTX-M-2型ESBLs基因、CTX-M-8型ESBLs基因、CTX-M-9型ESBLs基因的检出率均为0。基因存在的位置分别为仅在质粒上、仅在染色体上、同时在质粒和染色体上。通过χ2分析可知，肺源性KP与非肺源性KP之间的基因检出率、基因类型、基因位置、耐药性的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2、图1、图2。

2.2 抗菌药物敏感性试验 根据CTX-M型ESBLs的检出情况和是否是肺源性KP进行分组，第1组为CTX-M型ESBLs阳性组(n=48)，第2组为CTX-M型ESBLs阴性组(n=75)，第3组为肺源性KP组(n=54)，第4组为非肺源性KP组(n=69)。耐药结果见表3。

表2 肺源性KP与非肺源性KP的CTX-M型ESBLs基因检测情况[n(%)]

M：Marker(100～2 000 bp)；1：阳性对照；2：阴性对照；3～12：实验菌株。

图1 CTX-1型ESBLs基因的PCR产物电泳图

M：Marker(100～2 000 bp)；1：阳性对照；2：阴性对照；3～12：实验菌株。

图2 CTX-25型ESBLs基因的PCR产物电泳图

表3 123株KP对14种常用抗菌药物的耐药结果[n(%)]

3 讨 论

ESBLs在KP的检出率(46.34%)较伊朗报道的59.20%低，较北京等报道的32.21%高，但CTX-M型ESBLs基因占ESBLs的比率(84.21%)却高于伊朗的23.90%，而与北京等地的84.80%相近[6-7]。流行的CTX-M型ESBLs以CTX-M-1群酶为主(38.21%)，这与我国湖北、印度南部相同[8-9]，而不同于巴西累西腓市是以CTX-M-2群酶为主[10]。本地区只有CTX-M-1群酶和CTX-M-25群酶，但在巴西却可检测出CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8和 CTX-M-9群酶[11]，提示在呼吸道来源的KP中，其产ESBLs、携带CTX-M型ESBLs基因的情况均有地区差异性，这可能与各地区使用抗菌药物习惯或检测方法等不同有关。鉴于各类型CTX-M型ESBLs在KP中造成耐药程度等不同[12]，为了更好掌握来源于呼吸道KP的耐药形势，应加强CTX-M型ESBLs的检测和研究。

CTX-M 型 ESBLs 基因既可以位于质粒上又可以位于染色体上[13]。表2显示，KP上CTX-M型ESBLs基因的位置有3处：一处位于染色体上，二处位于质粒上，三处在染色体和质粒同时存在，并且以同时存在于质粒和染色体上最为常见，其中CTX-M-1同时存在于质粒和染色体上的菌株占CTX-M型ESBLs阳性株的72.92%[(14+18+2+1)/48]，这为CTX-M-1型ESBLs的播散提供便利的条件。突尼斯曾经出现位于质粒或染色体上的CTX-M型ESBLs在可移动遗传因子ISEcpI的作用下，使CTX-M型ESBLs基因在质粒与质粒中、质粒与染色体中、染色体与质粒中播散开来[14]。CTX-M-25群酶基因则主要存在染色体上，这与以色列存在于质粒上不同[15]。值得注意的是，CTX-M-1群酶和CTX-M-25群酶同时存在于一株KP的菌株已出现。提示随着抗菌药物在临床上的广泛使用，以及抗菌药物在畜牧业上应用日益频繁，细菌携带的耐药基因种类将会越来越多。临床应加强检测，防止耐药菌传播。

多种β-内酰胺类抗菌药物(如头孢唑林、头孢他啶等)在CTX-M型ESBLs阳性组的耐药率明显高于CTX-M型ESBLs阴性组(P<0.05)，提示KP对某些β-内酰胺类抗菌药物产生的耐药性与CTX-M型ESBLs关系密切，但头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦等在CTX-M型ESBLs阳性组与阴性组间的耐药率差异无统计学意义(P>0.05)，这可能与第4代头孢菌素类抗菌药物对β-内酰胺酶比较稳定、CTX-M型ESBLs可以被β-内酰胺酶抑制剂抑制有关[16]。目前KP往往同时携带多种耐药基因，其耐药表型是几种耐药机制共同作用的结果，这可能也是原因之一[11,17]。CTX-M型ESBLs最主要的特征就是大部分CTX-M 型 ESBLs(除CTX-M-6、CTX-M-15和CTX-M-19外)对头孢噻肟的水解力高于头孢他啶，但在西班牙发现，一些CTX-M型ESBLs突变体水解头孢他啶的能力和水解头孢噻肟的能力一样强，CTX-M-1型酶突变体的这种变化最明显[18]，表3显示，头孢他啶和头孢噻肟的耐药率相差明显，提示本地区的CTX-M-1并未突变，但也应注意这方面的动向。

值得注意的是，喹诺酮类抗菌药物左旋氧氟沙星和磺胺类抗菌药物复方磺胺甲恶唑在CTX-M型ESBLs阳性组的耐药率也明显高于阴性组(P<0.05)，这可能与携带CTX-M型ESBLs阳性株经常同时携带抗喹诺酮类抗菌药物基因和抗磺胺类抗菌药物基因有关[17]。值得一提的是，通过χ2分析可知，肺源性KP与非肺源性KP之间的基因检出率、基因类型、基因位置、耐药性的差异均无统计学意义(P>0.05)。

综上所述，在呼吸道来源的KP中，其携带CTX-M型ESBLs基因常见，而且位置多样化，并以KP耐药性关系密切。为了更好治疗KP引起的呼吸道感染，应重视CTX-M型ESBLs的研究和检测。

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Study on the resistance of klebsiella pneumoniae which come from respiratory tract and CTX-M ESBLs*

ZhongRuzhu1，XuZhiming1，YuYunmei2，LiuJun2,ZhaoZuguo2

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine，thePeople′sHospitalofLianjiang,Lianjiang，Guangdong524400，China; 2.LaboratoryofPathogenBiology，GuangdongMedicalCollege，Zhanjiang，Guangdong524023，China)

ObjectiveTo investigate the relationship between the resistance of klebsiella pneumoniae(KP) which come from respiratory tract and CTX-M extended spectrum β-lactamase(ESBLs).MethodsDetecting CTX-M ESBLs genes in the plasmid and chromosomes were used by PCR and sequence analysis;Disk diffusion method was sued by antibiotics susceptibility test;Chi square test was sued by analytic the data.ResultsCTX-M-1 ESBLs and CTX-M-25 ESBLs were detected in the KP and the total detection rate of CTX-M ESBLs was 39.02%(48 strains)，the detection rate of CTX-M-1 ESBLs was 26.02%(32 strains) which existence in the plasmid and chromosomes simultaneously.The resistance rate of β-lactam antibiotic cefazolin，fluoroquinolone antibiotic levofloxacin and sulfonamides antibiotic bactrim and so on in positive group of CTX-M ESBLs were significantly higher than negative group of CTX-M ESBLs(P<0.05).ConclusionCTX-M-1 ESBLs gene which concurrent in the plasmid and chromosomes may the most common.KP resistance to certain antibiotics closely is relate to the CTX-M ESBLs.

respiratory tract infections；klebsiella pneumoniae;extended spectrum β-lactamase

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.27.008

国家自然科学基金资助项目(81301473)；湛江市财政资金科技专项(2013A01007)；湛江市科技攻关项目(2014BO1184)；湛江市科技攻关计划(2012C3106022)；广东医学院面上项目(M2012005)。

：钟如柱(1981-)，本科，主治医师，主要从事呼吸道病原菌的耐药机制研究。

R446

A

1671-8348(2015)27-3768-04

2015-03-08

2015-05-10)