SALL4基因在胃癌组织中的表达及临床意义*

郭 勇，唐永梁，杨俊涛，张 鑫，刘 蕾

(1.重庆市长寿区人民医院普外科 401220；2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所肝胆外科，重庆 400042；3.第三军医大学大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆400042；4第三军医大学药学院，重庆400038)

论著·临床研究

SALL4基因在胃癌组织中的表达及临床意义*

郭 勇1，唐永梁2，杨俊涛2，张 鑫3，刘 蕾4

(1.重庆市长寿区人民医院普外科 401220；2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所肝胆外科，重庆 400042；3.第三军医大学大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆400042；4第三军医大学药学院，重庆400038)

目的检测人类婆罗双树样基因-4(SALL4)在胃癌组织中的表达及其与胃癌生物学行为的关系。方法采用逆转录PCR(RT-PCR)、Westrrn blot和免疫组织化学方法检测91例胃癌组织和37例正常胃黏膜中SALL4的表达，分析SALL4与胃癌临床病理特征之间的关系。结果SALL4在胃癌组织中阳性表达率为74.7%，显著高于正常胃黏膜组织阳性表达率18.9%(P<0.05)，而且随着胃癌分化程度的降低，SALL4的阳性率和表达强度逐渐增高；胃癌组织SALL4 mRNA和蛋白的表达水平均显著高于正常胃黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.05)；在胃癌组织中SALL4的阳性表达与肿瘤淋巴结转移(P=0.001)、分化程度(P=0.029)和浸润深度(P=0.050)密切相关。结论SALL4基因在胃癌组织中高表达，与淋巴结转移、分化程度和浸润深度密切相关，可能在胃癌发生、发展中起重要的作用。

胃肿瘤；免疫组织化学；SALL4

胃癌是临床常见恶性肿瘤之一，居全球肿瘤发病率的第4位，居我国发病率第2位[1-2]。胃癌早期无明显症状，大部分患者在诊断时已是晚期，错失最佳的治疗时机。因此，寻找胃癌新的肿瘤标记物，具有重要的科学意义和医学价值。人类婆罗双树样基因-4(SALL4)是一种新发现的原癌基因，多项研究表明，SALL4不仅是胚胎干细胞的特异标记物，而且在乳腺癌、前列腺癌、急性髓性白血病等多种肿瘤中均有表达[3-5]。目前，国内外尚未有关于SALL4在胃癌中的相关研究。本研究通过逆转录PCR(RT-PCR)、Western blot和免疫组织化学的方法，检测SALL4基因和蛋白在胃癌中的表达情况，并阐明其和临床病理学参数之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集第三军医大学大坪医院野战外科研究所普通外科2011～2013年手术切除胃癌标本91例，其中，男62例，女29例，平均年龄52岁。肿瘤直径大于5 cm 56例，小于或等于5 cm 35例；淋巴结转移 61例，无淋巴结转移30例，远处转移23例；癌旁组织37例，取自胃癌手术切端正常组织。本研究所有病例均经病理学检查确诊，术前未接受过化学治疗及放射治疗，并经过本院伦理委员会批准，获得患者的知情同意。

1.2 仪器与试剂 全封闭脱水机(德国Leica 1010)，全自动切片机(德国 Leicarm 2245)，全自动染色机(Leicaauto Stainer XL)，显微机(日本Olympus pm-20)及Olympus pm-C35DX成像系统。LightCycler定量PCR扩增仪(瑞士Roche)，Tanon凝胶图像分析系统(上海天能)。TaKaRa RNAiso试剂，逆转录PCR(RT-PCR)试剂盒，DNA Marker，逆转录试剂和PCR试剂(北京中杉)，SALL4 兔抗人多克隆抗体(Abcam)。其他试剂购自江苏碧云天生物技术研究所。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学法 SALL4检测采用免疫组织化学SP法，严格按照说明书操作。采用德国IECIA图像分析仪进行图像分析，SALL4免疫阳性物质定位于细胞核，呈棕色颗粒样。半定量判定：根据染色强度，依次为无色(0分)、淡黄色(1分)、棕黄色(2分)、棕褐色(3分)；染色范围(染色细胞所占的百分比)：阳性细胞小于5%(0分)，5%～25%(1分)，>25%～50%(2分)，>51%～75%(3分)，>75%(4分)。最后按染色强度与阳性细胞之积为免疫组织化学的结果，<2分为(-)，2～4分为(+)，5～8分为(++)，9～12分为(+++)。

1.3.2 RT-PCR 取100 mg胃癌组织，采用Trizol法提取总RNA，以RNA为模板，将RNA逆转录成cDNA。反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 s。引物由碧云天公司合成，SALL4引物序列为：5′-TCG ATG GCC AAC TTC CTT C-3′，5′-GAG CGG ACT CAC ACT GGA GA-3′，PCR产物为142 bp。以β-actin为内参，循环扩增条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，SALL4(61 ℃)/β-actin(55 ℃)，退火30 s,72 ℃延伸30 s，38个循环，72 ℃ 5 min。PCR扩增产物在3%琼脂糖凝胶中电泳，采用凝胶图像扫描系统对扩增产物的电泳条带进行吸光度(A)检测，计算出SALL4与β-actin的A比值，结果以SALI4/β-actin表示。

1.3.3 Western blot 组织匀浆后，加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，冰上裂解40 min。4 ℃，12 000 r/min离心10 min，将上清液移至新管，采用BCA法测蛋白浓度。分别配制10% 分离胶与5%浓缩胶，每孔上样30 μg，恒压电泳。将蛋白电转移到PVDF膜后，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。将目的条带孵育在β-actin和SALL4一抗中4 ℃过夜。次日室温孵育二抗1 h，曝光检测。

2 结 果

2.1 SALL4 免疫组织化学结果 在胃癌组织中，SALL4表达较强，主要定位于细胞核，呈棕色颗粒样；在正常胃黏膜组织中SALL4表达较弱，棕色颗粒较小；SALL4在胃癌组织中阳性表达率为74.7%(68/91)，显著高于正常胃黏膜组织阳性表达率18.9%(7/37)，差异有统计学意义(P<0.05)。随着胃癌分化程度的降低，SALL4的阳性率和表达强度逐渐增高。见图1。

表1 胃癌组织中SALL4 的表达与临床病理参数的关系[n(%)]

续表1 胃癌组织中SALL4 的表达与临床病理参数的关系[n(%)]

A:正常胃黏膜;B:胃高分化腺癌;C:胃低分化腺癌;D:SALL4组化评分。*：P<0.05，与正常胃黏膜比较。

图1 SALL4在正常胃黏膜、胃高分化腺癌和胃低分化腺癌中的表达

A：SALL4 mRNA比较;B：SALL4蛋白比较，T:肿瘤组织;N:正常胃黏膜组织。

图2 SALL4在正常胃黏膜和胃癌中mRNA和蛋白的表达水平

2.2 SALL4 mRNA和蛋白的表达水平 RT-PCR结果表明SALL4位于142 bp，胃癌组织中条带亮度显著高于正常胃黏膜组织，见图2；灰度扫描结果显示，胃癌组织SALL4 mRNA(3.15±0.42) 表达水平高于正常胃黏膜组织(0.27±0.08)(P<0.05)。Western blot结果同样表明，胃癌组织中SALL4 蛋白的表达量显著高于正常胃黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 SALL4 与胃癌临床病理参数的关系 SALL4在有淋巴结转移组的表达率为85.2%，高于无淋巴结转移组的表达率53.3%(P=0.001)；SALL4在中高分化组的表达率为67.2%，高于低分化组的表达率87.8%(P=0.029)；SALL4在浸润深度T1/T2组的表达率为62.9%，高于浸润深度T3/T4组表达率79.6%(P=0.050)；SALL4表达率与年龄、性别、远处转移和肿瘤大小等病理参数无关，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

3 讨 论

胃癌的发病机制尚未完全阐明，其中涉及癌基因(ras、c-myc、C-erb-2等)和抑癌基因(p21、p53等)的改变，上述基因表达的变化对胃癌的生物学行为和预后均有影响[6-8]。SALI4是一种新发现的原癌基因，定位于人类染色体20q13，属于SALL基因家族成员，含有4个外显子，为C2H2锌指蛋白转录因子，编码SALI4A和SALI4B两种异构体蛋白，表达于细胞核[9-10]。

近年来发现，SALL4基因的表达可激活Wnt、Bmi-1和Pten等通路，在早期胚胎发育和维持胚胎干细胞自我更新中发挥重要作用，而且SALL4在血液系统恶性肿瘤中异常表达，可能与白血病的发生、发展有密切关系[4，11]。在具有干细胞特性的肝癌亚型中，SALL4 表达与预后差密切相关，基因表达分析显示SALL4+肝癌细胞中，“干性”相关基因富集，提示SALL4 是具有侵袭表型的干/祖样肝癌细胞的分子标志[12]。在肠道肿瘤中，Forghanifard等[13]研究发现，SALL4 在结直肠癌组织中的表达比正常组织高出2倍多，并且与淋巴结转移密切相关，提示SALL4 可能是一个新的肿瘤转移的分子标志[13]。

本研究通过RT-PCR和Western blot方法检测SALL4在胃癌组织和正常胃黏膜组织中基因和蛋白的表达水平，发现胃癌组织中SALL4 mRNA和蛋白水平均显著高于正常胃黏膜组织(P<0.05)。免疫组织化学结果显示，SALL4在胃癌组织中阳性表达率为74.7%(68/91)，显著高于正常胃黏膜组织阳性表达率18.9%(7/37)，差异有统计学意义(P<0.05)。随着胃癌分化程度的降低，SALL4的阳性率和表达强度逐渐增高，说明SALL4可能与胃癌的分化程度相关。本研究中，SALL4的表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、分化程度密切相关，与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小无关(P>0.05)[4]。这与其他作者等在宫颈癌组织中的研究部分一致，张铭等[14]研究发现SALL4在宫颈癌组织中高表达，与宫颈癌的分化相关，SALL4的表达可能对宫颈癌的发生发展有重要作用。

综上所述，SALL4在胃癌组织中表达增加，而且与胃癌的分化程度呈负相关，进一步分析发现SALL4的阳性表达与浸润深度、淋巴结转移密切相关。因此，检测胃癌组织中SALL4蛋白的表达有助于胃癌的诊断及预后判断，但其具体的作用机制尚待进一步研究。

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[14]张铭，张一鸣，左伟，等．干细胞标志物SALL4在宫颈癌中的表达研究[J]．重庆医学，2014，43(3)：285-287

Expression and clinical significance of SALL4 expression in gastric carcinoma tissues*

GuoYong1，TangYongliang2，YangJuntao2,ZhangXin3，LiuLei4

(1.DepartmentofGeneralSurgery,People′sHospitalofChangshou，Chongqing401220，China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,InstituteofSurgeryResearch，DapingHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400042，China;3.DepartmentofGeneralSurgery，InstituteofSurgeryResearch，DapingHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400042，China;4.CollegeofMedicine，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China)

ObjectiveTo study the expression and clinical significance of the SALL4 in human gastric carcinoma tissues.MethodsThe expression of SALL4 in 91 samples of gastric carcinoma and 37 samples of normal gastric tissues was detected by RT-PCR，Western blot and immunohistochemistry，and its relationship with the clinical data were analyzed statistically.ResultsThe positive expression rate of SALL4 in gastric carcinoma(74.7%) was significantly higher than that(18.9%) in normal gastric mucosa tissues(P<0.05).Moreover，with the decreased with the differentiation of gastric carcinoma，the positive expression rate of SALL4 was increased.The expression of SALL4 mRNA and protein in gastric carcinoma tissues were significantly higher than that in normal gastric tissues(P<0.050).The expression levels of SALL4 were relevant to lymph node metastasis(P=0.001)，infiltration depth(P=0.029) and the differentiation degree of gastric carcinoma(P=0.050).ConclusionSALL4 was highly expressed in gastric cancer tissues and relevant to lymph node metastasis，infiltration depth and the differentiation degree，which may have play an important role in the development of gastric cancer.

gastric neaplasms;immunohistochemistry;SALL4

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.27.004

国家自然青年科学基金资助项目(81402013)。

：郭勇(1981-)，硕士，主治医师，主要从事消化道肿瘤方面的研究。

R735.2

A

1671-8348(2015)27-3756-03

2015-03-07

2015-06-27)