星点设计-响应面法优化黔产金樱子多糖超声提取工艺*

晏建新，王晓丽

(1.贵州医科大学药学院，贵阳 550004；2.贵州省人民医院药剂科，贵阳 550001)

星点设计-响应面法优化黔产金樱子多糖超声提取工艺*

晏建新1，2，王晓丽1

(1.贵州医科大学药学院，贵阳 550004；2.贵州省人民医院药剂科，贵阳 550001)

目的 优化黔产金樱子多糖的超声提取工艺和条件。方法 以液料比、提取时间和提取温度为自变量，以黔产金樱子多糖的提取率为因变量，对自变量各水平进行多元线性回归和二项式拟合，采用响应面法优选工艺条件，并进行预测分析。结果 黔产金樱子多糖优选工艺：液料比30：1( mL：g)，提取时间60 min，提取温度75 ℃，平均提取率37.54%。结论 优化的超声提取工艺和条件简便可靠。

金樱子，黔产；多糖；超声提取； 星点设计-响应面法

金樱子为蔷薇科植物金樱子(RosalaevigataeMichx)的干燥成熟果实[1]，在我国西南、华南、华中、华东均有分布，尤其以贵州省分布广，产量高[2]。金樱子主要活性成分为金樱子多糖(RosaLaevigataeMichx polysaccharide,RP)，鉴于多糖具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗衰老等药理作用[3]。响应面法( response surface methodology，RSM) 是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来优选工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[4]。星点设计(central composite design，CCD)是近年常用的设计方法，星点设计-响应面法(CCD-RSM)比正交实验法更加简化，比均匀设计法更加全面，其实验次数较少，实验精度高[5]，在中药提取中也有重大应用[6-7]。本实验引入CCD-RSM对金樱子多糖的超声提取工艺进行优化，通过实验测定金樱子多糖提取率，优选超声提取工艺。

1 材料与仪器

1.1 材料 金樱子采自贵州省遵义县团溪镇，经贵州医科大学药学院王晓丽教授鉴定为蔷薇科植物金樱子的成熟果实。葡萄糖标准品(中国食品药品检定研究院，批号：110833-200904)，浓硫酸、苯酚、无水乙醇均为分析纯，水为重蒸水。

1.2 仪器 SK3300H型超声清洗仪(上海超声设备有限公司)，UV-2401型紫外分光光度计(日本津岛)，FA2004分析天平 (上海舜宇恒平科学仪器有限公司，感量：0.1 mg)，HH-2恒温数显水浴锅(金坛市富华仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.051 6 g，置100 mL量瓶中溶解后定容，摇匀后浓度为0.516 mg·mL-1。

2.2 供试品溶液的制备 金樱子样品处理后置60 ℃恒温烘箱中烘干，自然冷却后粉碎过内径0.250 mm(60目)筛，干燥后[8]备用。称取上述干燥后样品按一定比例加重蒸水按不同条件超声提取[9]，滤过。取续滤液，稀释一定倍数，备用。

2.3 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL分别置50 mL量瓶中，均稀释至刻度，摇匀后分别精密吸取上述溶液2.0 mL置具塞试管中，各加4%苯酚1 mL，混匀，迅速加浓硫酸5.0 mL，混匀，置40 ℃水浴中加热30 min，取出后冰水浴中放置5 min，在波长490 nm测吸光度[9]，进行线性回归，得回归方程：Y=12.337X+ 0.090 2，r=0.999 0，其中Y为溶液质量浓度(mg· mL-1)，X为吸光度。线性范围为5.16～25.80 μg·mL-1。

2.4 金樱子多糖的测定 准确称取金樱子的粉末0.5 g，按“2.2”项下方法操作。精密吸取供试品溶液1.0 mL于25 mL量瓶中，双蒸水定容，摇匀，精密量取2.0 mL于具塞试管中，按“2.3”项下方法操作，在490 nm测吸光度。多糖提取率(%) =C×V/W×100，式中：C：金樱子提取液中葡萄糖浓度(mg·mL-1)；V：提取液总体积(mL)；W：金樱子干粉质量(mg)。

2.5 提取工艺优化

2.5.1 星点设计试验设计 通过Design-Expert7.0.0版软件，根据星点设计原理，每因素五水平，用代码值-α，-1，0，1，α表示三因素，α=(23)1/4，以液料比、提取时间和提取温度为自变量，金樱子多糖提取率为因变量进行优化，实验因素水平表见表1，实验安排见表2。

表1 实验因素水平表Tab.1 Factors and levels of the experiment

2.5.2 等高线图和响应面图分析 通过响应面优化实验分析可以得到相应的响应面图。响应面图可以直观地反映各自变量对多糖提取率的影响以及各自变量之间交互影响的强弱关系[10]。实验结果见响应面曲面图及等高线图，见图1～3。

表2 星点设计优化实验方案与结果

Tab.2 Optimization and results of central composite design

编号X1X2X3多糖提取率/%1001.73232.92211135.08301.732033.09400035.22511-128.94600-1.73224.517-11126.888-11-127.029-1.7320024.08101-1130.4611-1-1126.36121-1-127.5813-1-1-125.031400037.031500036.781600036.46171.7320032.261800036.271900037.85200-1.732025.04

从图1～3可以直观地看出：料液比对贵州产金樱子多糖提取率的影响最大，其描绘得到的曲线较为陡峭；其次是提取时间的影响，其曲线相对于料液比而言，相对平滑一些；影响最小的是温度，其曲线平滑，反映出的数值变化不大。按照回归模型预测的超声提取贵州产金樱子多糖的优选工艺条件是：液料比为35.64(mL：g)，提取时间为64.29 min，提取温度75.01 ℃。在此工艺条件下，预测提取得到贵州产金樱子多糖提取率为37.83%。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

图1 液料比与提取温度对多糖提取率的交互影响

Fig.1 Interation of ratio of water to material and temperature on polysaccharide yeild

图2 提取时间与液料比对多糖提取率的交互影响

Fig.2 Interation of time and ratio of water to material on polysaccharide yeild

图3 提取时间和提取温度对多糖提取率影响的交互影响

Fig.3 Interation of time and temperature on polysaccharide yield

2.5.3 验证实验 在优选出的工艺条件下，进行多次实验取平均值，再与数学模型预测值进行比较，其中实验值与预测值的偏差表示实验值偏离预测值的程度，其绝对值越小，说明预测性越好[11-16]。采用上述优选提取条件 (考虑到实际操作的情况，将多糖优选提取条件修正为料液比1：30、超声时间为60 min、超声温度75 min)，在此工艺条件下重复操作3次实际测得的平均多糖得率为37.54 %，与模型预测值的误差为0.8%。

3 讨论

利用响应面设计对影响金樱子多糖提取的各自变量进行了评价，影响程度：料液比>超声时间>超声温度。利用Dsign-Expert7.0.0版软件对进行响应面分析并建立了显著影响多糖提取率的二次回归模型，并利用统计学方法对模型进行显著性检验，优化各自变量水平，探讨各自变量间交互作用。试验结果表明CCD-RSM实验所得拟合方程可较好地描述多糖提取率与各自变量之间的关系，所建立的数学模型具有良好的预测性，所选工艺条件重复性好，参数真实可靠，且具有实际意义。超声提取应用规模较小，存在消除噪声方面的问题及提取机理尚不明确。《中华人民共和国药典》中金樱子多糖的水浴回流法提取工艺步骤繁琐，耗时长，而本文应用超声提取快速有效，科学合理，为金樱子多糖提取工艺的研究提供新方法，具有实际的指导意义和良好的应用前景，为《中华人民共和国药典》质量标准的修订提供一定的理论依据。

采用CCD-RSM对贵州产金樱子多糖的超声提取工艺进行优化研究，得到和实验结果拟和程度较高的数学模型和较优的贵州产金樱子多糖提取工艺条件。最终结论为：料液比1：30、超声时间为60 min、超声温度75 ℃，实际上金樱子多糖提取率为37.54%，该工艺简便快速可行。

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Optimization of Ultrasonic Extraction for Polysaccharide from Rosa Laevigatae Michx in Guizhou by Central Composite Design-Response Surface Methodology

YAN Jianxin1,2，WANG Xiaoli1

(1.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004,China；2.DepartmentofPharmacy，GuizhouProvinicalPeople'sHospital，Guiyang550001,China)

Objective To select the optimum ultrasonic extracting method of polysaccharides fromRosaLaevigataeMichx inGuizhou. Methods Independent variables were solid-liquid ratio, extraction time and extraction temperature, dependent variable was extraction rate ratio of polysaccharides fromRosaLaevigataeMichx.Linear or nonlinear mathematic models were used to estimate the relationship between independent and dependent variables.Response surface methodology was used to optimize the process of extraction.Prediction was carried out through comparing the observed and predicted value. Results The optimum extraction condition for the polysaccharides was as follows: extracting at 75 ℃ for 60 min and ratio of liquid to solid 30：1 ( mL：g).The average extraction yield of polysaccharides was 37.54% under the optimum extraction condition. Conclusion This optimized extraction process is simple and reliable for the extraction of polysaccharides fromRosaLaevigataeMichx inGuizhou.

RosaLaevigataeMichx inGuizhou；Polysaccharides；Ultrasonic extraction；Central composite design-response surface methodology

2014-11-17

2015-02-27

*贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目(黔科合ZY字[2012]3004号)

晏建新(1972-)，女，湖南隆回人，主管药师，硕士，研究方向：中草药开发与应用。电话：(0)15761600430，E-mail：850144305@qq.com 。

王晓丽(1956-)，女，贵州贵阳人，教授，学士，研究方向：中草药开发与应用。电话：(0)18984391719，E-mail： 346195348@qq.com。

R282.71；TQ460.6

B

1004-0781(2015)10-1367-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.028