PCR-DGGE技术研究大豆内生细菌多样性

刘宇帅，李晶，张淑梅，孟利强

（1.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150010；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150020）

PCR-DGGE技术研究大豆内生细菌多样性

刘宇帅1，2，李晶1，2，张淑梅1，2，孟利强1，2

（1.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150010；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150020）

本研究采用了巢氏PCR法，先以799F-1492R引物，以大豆基因组DNA为模板进行扩增，将目的条带切胶回收并进行第二步PCR，其中以GC-968F-1378R为引物，最终得到了V6、V7、V8三个高变区的目的片段（470bp）。采用分子生物学技术PCR-DGGE分析大豆内生细菌多样性发现，大豆叶片中的内生细菌多样性要小于根部和茎部；大豆不同的品种间存在很多共有条带，而每个不同品种又存在各自的特有条带；在大豆的各个不同生长时期内生细菌多样性逐渐增加，只有在结荚期内生细菌多样性最小。

大豆；内生细菌；PCR-DGGE；多样性

植物内生细菌是一种十分重要的生防细菌来源，研究植物内生细菌已成为控制植物病害的一条有效途径［1］。内生细菌能够抑制植物病原菌的侵入和生长，而且可以促进植物的生长。内生细菌能够占据植物体内有利生态位，而且不易受环境条件的影响，能够定殖于植株相应部位抵抗病原物的入侵［2］。随着植物内生细菌的深入研究，其生防价值日益突出，研究植物内生细菌可以发挥内生细菌的有益生物学作用，防治植物病害，提高作物生产力，将为我们带来良好的经济和社会效益。

本研究通过非培养方法揭示了大豆内生细菌的种群多样性特征信息及动态分布，发现不同大豆品种内生细菌的种群存在差异，揭示了各个大豆品种不同生长期植株根、茎、叶不同部位内生细菌种群结构以及动态变化情况，将有利于开发植物内生细菌这个巨大的微生物资源宝库，带来巨大的社会效益［3,4］。

1 实验方法

1.1 样品总DNA的提取与纯化

采用TIANamp Bacteria DNA Kit基因组提取试剂盒（TIANGEN）提取基因组，提取大豆植株样本总DNA。

利用Universal DNA Purification Kit总DNA纯化回收用试剂盒（TIANGEN），按说明书操作。

1.2 大豆内生细菌16S rDNA片段的PCR扩增

大豆植株样本内生细菌的16S rDNA片段PCR扩增利用巢式PCR方法，以大豆样本总DNA为模板，细菌通用引物799F(AACAGGATTAGATACCCT G)和1492R(GGTTACCTTGTT ACGACTT)扩增细菌16S rDNA片段，这样可以免去大豆植株体细胞中线粒体及叶绿体遗传物质的干扰。将扩增产物中分子量为740 bp左右的片段回收，并将其作为模板，选用引物968F(AAC GCG AAG AAC CTT AC)和1378R (CGG TGT GTA CAA GGC CCG)扩增细菌16S rDNA的V6-V8高变区［5］。引物合成时，在引物968F的5'端加上40个碱基的GC夹(GCCGGGCCGGGG GCACCGCGCGGG GCGGCGGGGCCGCGCGG)，引物由宝生物有限公司合成，扩增试剂均购自TIANGEN公司。

PCR扩增方法、反应体系及回收方法参照文献［6］。

1.3 DGGE对大豆内生细菌多样性分析

根据DGGE条件优化的结果，制备聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度为25%～75%，预电泳条件为55℃，120 V电泳10 min，然后取各样品15 μL加入各点样孔，在120 V电压下，电泳10 h。

电泳完成后采用银染法对凝胶进行染色，并采用Quantity One分析软件对各个样品的DGGE分离条带进行分析。主要分析各个条带的迁移速率、灰度指数及数量关系。分析各样品在DGGE图谱中的各个参数，采用Shannon-Weiner指数(H)，丰富度指数(S)和均匀度指数(E)等指标比较各个样品内生细菌的多样性［7］。

2 结果与讨论

2.1 大豆基因组DNA的提取

内生细菌基因组总DNA的提取是分析其种群多样性的关键。通过实验结果可以看出图1，基因组主条带清晰且没有弥散条带，只有部分RNA存在，可以通过纯化回收避免对下一步PCR实验的影响。

图1 总DNA的提取检测Fig.1 Abstracting and testing of total DNA

2.2 DGGE对大豆内生细菌多样性分析

2.2.1 大豆不同组织部位内生细菌多样性比较

大豆同一时期不同组织部位内生细菌16S rDNA PCR产物的变性梯度凝胶电泳结果如图2所示。不同的样品经变性梯度凝胶电泳后，都分离得到数目不等的电泳条带，并且每个条带的染色强度和迁移率各不相同，有一些条带染色强度较高，也有一些条带染色强度较弱。由图2可以看出，根部和茎部内生细菌DGGE图谱较为相似，存在很多共有条带，说明根部和茎部存在很多共有内生细菌类型。而叶片的内生细菌条带数量要明显少于根部和茎部，说明叶片中的内生细菌多样性要小于根部和茎部。

图2 大豆不同组织部位内生细菌16S rDNA-PCR产物DGGE图谱Fig.2 DGGE Spectrum of Endophytic bacteria 16s rDNA-PCR's product at different tissue of soybean

细菌多样性指数是用来分析细菌物种数和个体数量以及均匀度分布的综合指标［8］。根据电泳图谱中每个条带的强度，采用Quantity One软件对大豆不同组织部位中细菌多样性指数(H)、均匀度(E)和丰富度(S)进行分析，结果如表1。结果显示，大豆根部和茎部的内生细菌多样性指数(H)相似，分别为3.57和3.32，而叶片中的内生细菌多样性指数(H)仅为1.89，远小于根部和茎部。

表1 大豆不同组织部位内生细菌多样性指数、均匀度及丰富度Tab.1 Diversity factor,unity and abundance of endophytic bacteria at different tissue of soybean

2.2.2 大豆不同品种内生细菌多样性比较

分别于同一生长时期，取黑农59和合丰55两个品种大豆的同一部位内生细菌进行16S rDNA PCR-DGGE分析，电泳图谱如图3所示。由图谱可以看出，黑农58和合丰55存在很多共有条带，如k1、k2、k3、k4、k6、k7、k8，说明大豆不同品种间存在很多共有内生细菌类型。除共有条带外，不同大豆品种均具有各自特有的条带，如h1和h2只有在黑农58存在，而k5只在合丰55中存在，说明每个品种都具有各自特有的细菌类型。

图3 黑农58、合丰55内生细菌16S rDNA-PCR产物DGGE图谱Fig.3 DEEG spectrum of endophytic bacteria 16s rDNA-PCR's product in Heinong 58 and Hefeng 55

对大豆不同品种内生细菌多样性指数(H)、均匀度(E)和丰富度(S)进行分析，结果如表2。黑农58和合丰55的“香农——维纳”多样性指数分别为3.44、3.49，说明这两个大豆品种内生细菌都具有丰富的多样性。

表2 黑农58、合丰55内生细菌多样性指数、均匀度及丰富度Tab.2 Diversity factor,unity and abundance of endophytic bacteria in Heinong 58 and Hefeng 55

2.2.3 大豆不同生长时期内生细菌多样性比较

同一品种不同生长时期大豆内生细菌16S rDNA PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）结果如图4所示。其中大豆分枝期和开花期的内生细菌条带要多于出苗期和结荚期。大豆分枝期和开花期共有的内生细菌条带最多，出苗期特有的内生细菌条带较多，如m1、m2，结荚期内生细菌条带数量最少。

图4 大豆不同生长时期内生细菌16S rDNA-PCR产物DGGE图谱Fig.4 DEEG spectrum of endophytic bacteria 16s rDNA-PCR's product in soybean at different growing stages.

对大豆不同生长时期内生细菌多样性指数(H)、均匀度(E)和丰富度(S)进行分析，结果如表3。“香农-维纳”多样性指数显示，随着大豆的出苗期、分枝期以及开花期的出现，内生细菌多样性逐渐增加，而在结荚期内生细菌多样性最小，大豆内生细菌多样性在分枝期、开花期最丰富。

表3 大豆不同生长时期内生细菌多样性指数、均匀度及丰富度Tab.3 Diversity factor,unity and abundance of endophytic bacteria in soybean at different stages

3 结论

本研究选用的巢氏PCR法适合进行大豆内生细菌多样性研究，可以获得大豆内生细菌16S rDNA的V6、V7、V8三个高变区的目的片段。采用PCR-DGGE分析大豆内生细菌多样性发现，大豆叶片中的内生细菌多样性要小于根部和茎部；大豆不同的品种间存在很多共有条带，而每个不同品种又存在各自特有的条带；在大豆的各个不同生长时期内生细菌多样性逐渐增加，而在结荚期内生细菌多样性最小。

［1］林玲，乔勇升，顾本康，等.植物内生细菌及其生物防治植物病害的研究进展［J］.江苏农业学报，2008，（06）:969-974.

［2］喻江，于镇华，刘晓冰，等.植物根组织内生细菌多样性及其促生作用［J］.中国农学通报，2015，（13）:169-175.

［3］孙磊.非培养方法和培养方法对水稻内生细菌和根结合细菌的研究［D］.北京：首都师范大学，2006.

［4］刘丹，张丽萍，史延茂，等.生防细菌对植物根围微生态效应的研究进展［J］.中国农学通报，2014，（07）:260-265.

［5］夏冬亮.毛竹根部内生细菌多样性研究［D］.保定：河北大学，2009.

［6］孟利强，赵晓宇，张先成，等.大豆内生细菌种群多样性PCR-DGGE分析方法的优化研究［J］.黑龙江大学自然科学学报，2013，（03）:390-395.

［7］聂志娟，徐钢春，程起群，等.海洋生境刀鲚菌群PCR-DGGE指纹图谱构建及分析［J］.海洋科学，2014（10）:63-69.

［8］刘国红，刘波，车建美，等.仙草植物内生芽胞杆菌种群多样性研究［J］.氨基酸和生物资源，2015，（01）:35-40.

Study on Diversity of Soybean Endophytic Bacteria by PCR-DGGE Technology

LIUYu-shuai1,2,Li jing1,2,ZHANGShu-mei1,2,MENGLi-qiang1,2
（1.High Tech Research Institute,HeilongjiangAcademyofSciences,Harbin 150010，China；
2.Institute ofMicrobiology,HeilongjiangAcademyofSciences,Harbin 150020,China）

By nested PCR method and with 799F~1492R as primers,the genomic DNA of soybean has been amplified.Then we recycled the target DNA from the gel and conducted the second PCR with primers GC-968F-1378R.Finally we got the target fragment(470bp)of three high variable regions(V6,V7,V8).PCR-DGGE was used to analyze the diversity of endophytic bacteria of soybean.The diversity of endophytic bacteria in soybean leaves was less than that in roots and stems,and there were many common bands in different varieties of soybean,while each of the different varieties have their specific bands.During different growth periods of soybean the diversities of endophytic bacteria gradually increase,onlyin the pod bearingperiod endophytic bacteria diversityreached the minimum.

Soybean;Endophytic Bacteria;PCR-DGGE;Diversity

S565.1

A

1674-8646（2015）10-0008-03

2015-08-14