白藜芦醇通过Sirt-1降低卵巢上皮细胞癌侵袭性作用机制的研究

高慧

（菏泽医学专科学校，山东菏泽274000）

白藜芦醇通过Sirt-1降低卵巢上皮细胞癌侵袭性作用机制的研究

高慧

（菏泽医学专科学校，山东菏泽274000）

目的探讨白藜芦醇对卵巢上皮细胞癌侵袭能力的影响。方法人卵巢癌细胞分为三组，低转移组，高转移组，高转移+白藜芦醇组，分别提取蛋白和RNA，Western Blot测定MMP-7、Sirt-1、AP-1的蛋白表达水平，RT-PCR测定MMP-7的基因转录水平。结果白藜芦醇可以明显的激活高转移卵巢上皮细胞癌当中Sirt-1的作用，与高转移组相比，Sirt-1的表达明显增加（P＜0.05），白藜芦醇抑制卵巢上皮细胞癌当中AP-1和MMP-7的表达（P＜0.05）。结论白藜芦醇具有明显的降低卵巢上皮细胞癌侵袭性的药理作用，这种作用和其上调Sirt-1的表达密切相关。

白藜芦醇；去乙酰化酶；MMP-7；AP-1

目前在临床上，卵巢癌的诊断仍然存在着一定的困难。多数情况下，当卵巢癌发展到中晚期的时候才能够确诊，此时的治疗手段已经非常有限，影响患者预后[1]。因此，探索卵巢癌更为有效的诊断和治疗方法就显得非常重要，而阐明卵巢癌的发病机制则有可能为卵巢癌的诊断和治疗方法带来革命性的进展。白藜芦醇是一种生物活性很强的天然多酚类物质，目前发现它也是肿瘤的化学预防剂，对于很多肿瘤细胞，比如肺癌、肝癌、结肠癌以及乳腺癌等。白藜芦醇可以抑制肿瘤的转移以及诱导肿瘤细胞的凋亡[2,3]，但是白藜芦醇对于卵巢癌的作用报道较少，且抗肿瘤的具体机制尚未完全阐明。为此，我们对其进行了研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源低转移人卵巢癌细胞株HO-8910，高转移人卵巢O-8910pm，购自中国科学院上海细胞研。

1.1.2 主要试剂核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒：北京碧云天生物技术有限公司。BCA蛋白定量试剂盒：大连波利盾生物技术有限公司。RNA稳定剂：大连波利盾生物技术有限公司。RT-PCR试剂盒和PCR引物均购自大连宝生物有限公司。兔抗鼠Sirt-1抗体：美国Abcam公司。兔抗鼠AP-1抗体：美国Bioworld公司。兔抗鼠β-actin抗体：美国Santa Cruz公司。山羊抗兔二抗：北京中杉金桥生物技术有限公司。ECL显色试剂盒：大连波利盾生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器设备SCP7OH低温超速离心机：日本HITACHI公司。TS-A脱色摇床：江苏金坛中大仪器厂。电泳仪及胶架：大连竞迈生物科技有限公司。9700型RT-PCR仪器：美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养HO-8910及HO-8910pm细胞在含有10%的胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养，37℃、5%CO2培养箱中孵育，隔天传代一次。

1.2.2 药物处理与分组将对数生长期的细胞分为三组，低转移对照组、高转移模型组和高转移白藜芦醇处理组，低转移组细胞为HO-8910细胞（只加入10%的胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养），高转移组细胞为HO-8910pm细胞（只加入10%的胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养），高转移白藜芦醇处理组细胞为HO-8910pm细胞（在加入10%的胎牛血清的DMEM/F12培养液中同时加入40μmol/L白藜芦醇培养）。

1.2.3 Western Blot测定去乙酰化酶（Sirt-1）、AP-1、MMP-7蛋白表达水平药物处理完成后，收集细胞，使用蛋白提取试剂盒提取胞浆蛋白以及核蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，将每一样本的蛋白浓度定量至5μg/μL，然后进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后根据胶上Maker的位置裁取大小合适的分离胶，并且裁取大小与分离胶一致的滤纸和PVDF膜进行转膜，蛋白封闭液封闭2 h时，用TTBS将封闭液冲洗干净，一抗4℃过夜，TTBS冲洗三遍，二抗37℃孵育2 h，然后使用ECL试剂盒显色，凝胶成像系统拍照。1.2.4 RT-PCR测定MMP-7、Sirt-1的基因转录水平收集细胞，使用RT-PCR试剂盒提取RNA，分光光度法检测完RNA纯度以及完整性之后，配置RTPCR反应体系，并在体系中加入引物（MMP-7上游引物序列：5’-CGGCATCCAGGTTATCGGGG-3’，下游引物序列：5’-TGGGCAACAAATATGAGAGAGC-3’，Sirt-1上游引物序列：5’-CCCAGCTCCAGTCAGAACTAT-3’Sirt-1下游引物序列：5’-TTGGCACCGATCCTCGAAC-3’），然后进行RT-PCR，RTPCR结束后进行琼脂糖电泳凝胶并进行成像分析。

1.3 统计学处理应用SPSS20.0软件，所获数据采用方差分析和t检验。

2 结果

2.1 Western-blot检测白藜芦醇对卵巢上皮细胞癌MMP-7蛋白表达的影响低转移人卵巢癌细胞株HO-8910中，MMP-7有一定数量的表达，但总体水平较低。与低转移卵巢癌细胞株相比，在高转移人卵巢癌细胞株HO-8910pm中，MMP-7的表达明显上升（P＜0.01），经过白藜芦醇的处理之后，在高转移人卵巢癌细胞株HO-8910pm中，MMP-7的表达明显下降（P＜0.05）。见图1。

图1 各组细胞当中MMP-7的蛋白表达（A：HO-8910细胞；B：HO-8910pm细胞；C：白藜芦醇处理的HO-8910pm细胞）

2.2 RT-PCR检测白藜芦醇对卵巢上皮细胞癌MMP-7基因转录的影响在低转移人卵巢癌细胞株HO-8910中，MMP-7mRNA的转录水平较低。而在高转移人卵巢癌细胞株HO-8910pm中，与低转移人卵巢癌细胞株相比，MMP-7基因转录水平明显上升（P＜0.05），经过白藜芦醇的处理之后，在高转移人卵巢癌细胞株HO-8910pm中，MMP-7转录水平明显下降（P＜0.01）。见图2。

图2 各组细胞当中MMP-7mRNA的蛋白表达（A：HO-8910细胞;B：HO-8910pm细胞；C：白藜芦醇处理的HO-8910pm细胞）

2.3 Western-blot检测白藜芦醇对卵巢上皮细胞癌AP-1蛋白表达的影响在低转移人卵巢癌细胞株HO-8910pm中，AP-1蛋白的表达水平较低。在高转移人卵巢癌细胞株HO-8910pm中，与低转移卵巢癌细胞株相比，AP-1的表达明显上升（P＜0.05），而经过白藜芦醇的处理之后，在高转移人卵巢癌细胞株HO-8910pm中，AP-1的表达明显下降（P＜0.05），见图3。

图3 各组细胞当中AP-1的蛋白表达（A：HO-8910细胞；B：HO-8910pm细胞；C：白藜芦醇处理的HO-8910pm细胞）

2.4 Western-blot检测白藜芦醇对卵巢上皮细胞癌Sirt-1蛋白表达的影响在低转移人卵巢癌细胞株HO-8910中，Sirt-1蛋白的表达水平较高。而在高转移人卵巢癌细胞株HO-8910pm中，与低转移卵巢癌细胞株相比，Sirt-1的表达明显降低（P＜0.01），而经过白藜芦醇的处理之后，在高转移人卵巢癌细胞株HO-8910pm中，Sirt-1的表达明显上升（P＜0.05）。见图4。

图4 各组细胞当中Sirt-1的蛋白表达（A：HO-8910细胞；B：HO-8910pm细胞；C：白藜芦醇处理的HO-8910pm细胞）

3 讨论

Sirt-1曾经叫做“长寿基因”，广泛存在于包括卵巢细胞的哺乳动物的细胞中。目前已经证实Sirt-1是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙酰化酶，并认为其在很多疾病中扮演者重要的角色，比如冠心病、Ⅱ型糖尿病、器官纤维化以及阿尔茨海默病[4]。但是Sirt-1在恶性肿瘤的发病过程中的作用尚未完全阐明，目前的一些研究认为Sirt-1的表达对恶性肿瘤有着一定程度的诱导分化凋亡的作用[5]，但是也有一些研究则持有相反的观点[6]。在卵巢癌细胞当中，Sirt-1的高表达可以在一定程度上抑制卵巢癌细胞的侵袭能力。

白藜芦醇抑制卵巢癌细胞侵袭性的药理作用和Sirt-1的激活有着密切的联系[7]。在低转移的卵巢癌细胞当中，Sirt-1有着一定数量的表达，而在高转移的卵巢癌细胞当中，Sirt-1的蛋白表达水平明显下调，而经过白藜芦醇的诱导之后，Sirt-1的基因转录和蛋白表达水平有了明显的提高。实验数据提示白藜芦醇抑制卵巢癌细胞侵袭能力的药理作用和Sirt-1的激活有着密切的联系，Sirt-1可能是抑制卵巢癌细胞侵袭能力的一个新靶点，我们认为Sirt-1抑制肿瘤细胞增殖的作用主要体现抑制MMP-7的表达。

MMPs来源于包括肿瘤细胞在内的多种细胞，它调控了机体的很多生理功能和病理过程，尤其在器官纤维化或硬化、慢性阻塞性肺疾病、心脏重构、肾小球肾炎、腹膜炎、组织溃疡等结缔组织疾病的发生和进展过程中起着相当重要的作用[8-10]。目前的研究显示MMPs的表达同样与肿瘤的增殖及转移密切相关，MMP-7的高表达往往提示肿瘤细胞具有比较高的增殖及转移能力[11]，实验当中，低转移的卵巢癌细胞当中的MMP-7的表达呈现出低水平，而高转移的卵巢癌细胞当中的MMP-7表达量明显升高，而高转移卵巢癌细胞经过白藜芦醇的作用之后，MMP-7的表达水平明显降低，这也证实了MMP-7的表达与肿瘤的转移能力密切相关。我们用RT-PCR在转录水平上检测了MMP-7的表达，证实了在高转移的卵巢癌细胞株当中，MMP-7的转录水平上升，经过白藜芦醇的作用后，MMP-7的转录水平下降。白藜芦醇有着明显的抑制肿瘤转移的作用，而这种作用与抑制MMP-7的转录与表达密切相关。

为了进一步阐明Sirt-1负性调节MMP-7表达的分子作用机制。为此，我们对MMP-7上游的转录因子AP-1做了深入的研究。AP-1是一种转录因子，与很多生长因子、细胞因子以及MMP的转录激活密切相关[12,13]。AP-1激活后从细胞质移位至细胞核，与特定的DNA序列结合[14]，从而激活MMP-7的转录，导致MMP-7的转录水平上升。我们的数据显示与低转移细胞相比，在卵巢癌高转移细胞当中，核蛋白中的AP-1表达水平明显上升，而高转移细胞经过白藜芦醇的治疗之后，核蛋白中AP-1的表达明显下降。这证实了白藜芦醇抑制了AP-1的激活，从而使MMP-7的表达水平下降。

目前的研究显示AP-1是Sirt-1的调控位点之一，Sirt-1与AP-1相互作用，从而抑制AP-1的激活，降低了MMP-7的表达[15,16]。实验数据显示，在高转移的卵巢癌细胞当中，Sirt-1在基因转录和蛋白表达水平明显下调，经过白藜芦醇的治疗，Sirt-1表达水平上升。Sirt-1的激活抑制了AP-1的表达，这与Sirt-1抑制MMP-7的表达呈现出相同的趋势，这提示Sirt-1抑制MMP-7的表达是通过抑制AP-1的表达实现的。

综上所述，我们的研究显示白藜芦醇具有明显的抑制卵巢癌细胞转移的作用，而这种作用与激活Sirt-1的表达从而抑制AP-1和MMP-7的表达密切相关。

[1]Gmyrek L,Jonska-Gmyrek J,Zolciak,et al.Siwinska A.Therapeutic value of lymphadenectomy in ovarian cancer patients[J].Ginekol Pol. 2014,85(10):788-791.

[2]侯西栋,李红,许启泰.白藜芦醇抗肿瘤转移作用研究[J].河南大学学报(医学版),2013,9:45-47.

[3]Hotnog D,MihäiläM,Lancu IV,etal.Resveratrolmodulates apoptosis in 5-fluorouracyl treated colon cancer cell lines[J].Roum Arch Microbiol Immunol.2013,72(4):255-264.

[4]Rehan L,Laszki-Szczächor K,Sobieszczańska M,etal.SIRT1 and NAD as regulatorsofageing[J].Life Sci.2014,105(1-2):1-6.

[5]Wang,R.H,Sengupta,K,Li,et al.Impaired DNA damage response, genome instability,and tumorigenesis in SIRT1mutantmice[J].CancerCell,2008,14(4):312-323.

[6]ChenWY1,Wang DH,Yen RC,etal.Tumor suppressor HIC1 direct

ly regulates SIRT1 tomodulate p53-dependent DNA-damage responses[J].Cell,2005,123(3):437-448.

[7]Xia N,Strand S,Schlufter F,etal.Role of SIRT1 and FOXO factors in eNOS transcriptional activation by resveratrol[J].Nitric Oxide，2013,（32）:29-35.

[8]Arriola Benitez PC1,Scian R,ComerciDJ,etal.Brucella abortus induces collagen deposition and MMP-9 down-modulation in hepatic stellate cells via TGF-β1 production[J].Am JPathol,2013,183(6): 1918-1927.

[9]Jia ZB,Tian H,Kang K,et al.Expression of the tissue inhibitor of metalloproteinase-3 by transplanted VSMCsmodifiesheart structure and function after myocardial infarction[J].Transpl Immunol,2014, 30(4):149-158.

[10]DanilewiczM,Wagrowska-DanilewiczM.Differentialglomerular immunoexpression ofmatrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 in idiopathic IgA nephropathy and Schoenlein-Henoch nephritis[J]. Folia Histochem Cytobiol,2010,48(1):63-67.

[11]Sakamoto N1,Naito Y,Oue N,etal.MicroRNA-148a is downregulated in gastric cancer,targetsMMP7,and indicates tumor invasivenessand poorprognosis[J].Cancer Sci.2014,105(2):236-243.

[12]Hsieh MJ,Lin CW,Yang SF,etal.Glabridin inhibitsmigration and invasion by transcriptional inhibition ofmatrixmetalloproteinase 9? through modulation of NF-κB and AP-1 activity in human liver cancer cells[J].Br JPharmacol.2014,171(12):3037-3050.

[13]Zhu G,Kang L,Wei Q,et al.Expression and regulation of MMP1, MMP3,and MMP9 in the chicken ovary in response to gonadotropins,sex hormones,and TGFB1[J].Biol Reprod,2014,90(3):57.

[14]Lin CW,Chen PN,Chen MK,etal.Kaempferol reduces?matrixmetalloproteinase-2 expression by down-regulating ERK1/2 and the activator protein-1 signaling pathways in oral cancer cells[J].PLoS One.2013,8(11):e80883.

[15]Jia ZC,Wan YL,Tang JQ,et al.ERK1/2 and p38 MAPK signaling pathways in human colon cancer cell[J].Int JColorectal Dis.2012, 27(4):437-445.

[16]Lee SJ,Kim MM.Resveratrol with antioxidant activity inhibitsmatrixmetalloproteinase viamodulation of SIRT1 in human fibrosarcoma cells[J].Life Sci.2011,88(11-12):465-472.

Resveratrol A ttenuates the M etastasis of Epithelial Ovarian Carcinom a by Sirt-1

Gao Hu i
（HezeMedicalCollege，Heze 274000,Shandong）

ObjectiveTo study the effects of resveratrol in ovarian epithelial carcinoma and explore themolecular mechanism.MethodsHuman ovarian cancer cellswas divided into three groups,(A)low metastasis group(B)highme⁃tastasis group(C)highmetastasisgroup w ith resveratrol,then extraction protein and RNA respectively,Western blotanaly⁃siswereused to determine the effectof resveratrolon theexpression levelsof SIRT1,AP-1,and MMP-7 proteinsand RTPCR assay were used to determ ine the genetic transcription level of MMP-7.Resu lts Western Blot analysis and RTPCR revealed that the levelsof MMP-7 and AP-1 were significantly upregulated in highmetastasisovarian epithelial car⁃cinoma,however resveratrol attenuated the levels of MMP-7 and AP-1（P＜0.05),correspondingly,resveratrol could in⁃crease the expression of Sirt1(P＜0.05).Conc lusion Resveratrol could inhibitmetastasis of ovarian epithelial carcinoma mediated by Sirt1 activation.

Resveratrol；Sirt-1；MMP-7;AP-1

R373.31；R446.62

A

1008-4118（2015）03-0001-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2015.03.001

2015-05-12