猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及部分性质

傅 婷，王 丹，万 骥，唐云明*

猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及部分性质

傅 婷，王 丹，万 骥，唐云明*

（西南大学生命科学学院，重庆市甘薯工程研究中心，三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715）

新鲜猪肝经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析，获得电泳纯的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）。纯化结果显示：该酶比活力为1 622.33 U/mg，回收率为29.05%，纯化倍数为34.58；该酶分子质量约为171.79 kD，亚基分子质量约为43.68 kD。ADH酶学性质研究显示：最适反应温度和pH值分别为45 ℃和10.0；在25～45 ℃及pH 7.5～9.0范围内稳定性较好；最适条件下测得该酶对乙醇的Km值为19 mmol/L；正丁醇、氯仿、异丙醇、十二烷基硫酸钠、草酸、Zn2+、Cu2+、Ag+对该酶的抑制作用最强，Mg2+对该酶有激活作用，EDTA对该酶有双重作用。

猪肝；乙醇脱氢酶；分离纯化；酶学性质

乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）广泛存在于人和哺乳动物的肝脏、植物组织及微生物中，是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，作为生物体内主要短链醇代谢的关键酶，其在很多生理过程中起着重要作用[1-6]。该酶广泛应用于临床、化工及食品等领域[7-9]。国内市场上的ADH产品几乎都来源于酿酒酵母，因其来源单一、且高纯度ADH价格昂贵，所以寻求来源广泛、纯度高、成本低廉的ADH在理论和实践方面均具有十分重要的意义。目前国内外研究人员已对多种来源的ADH进行了相关研究[10-12]，但尚未见猪肝ADH的相关报道。本实验以价廉易得的猪肝为原材料提取ADH并对其部分酶学性质进行研究，旨在为ADH的获得提供一条新途径，更为以后对ADH的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜猪肝 重庆市北碚区永辉超市。

考马斯亮蓝R-250、三羟甲基氨基甲烷 美国Bio-Rad公司；DEAE-Sepharose、蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）标准品及Superdex-200凝胶层析分子质量标准品 美国GE Healthcare公司；甲叉-双丙烯酰胺、丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

UV-2550型分光光度计、蛋白核酸定量仪 日本岛津公司；MC4L冷冻干燥机 德国Uni Equip公司；Mill-Q plus超纯水仪 美国Millipore公司；pHS-32W微电路pH计 上海理达仪器厂；精密电子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；AKTA prime plus蛋白质纯化系统 美国GE公司；垂直板电泳槽和电泳仪 美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1猪肝ADH粗酶液的制备

将新鲜猪肝去除结缔组织和脂肪，称取50 g，用剪刀剪碎后按1∶4的比例加入预冷的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，匀浆后放于4℃冰箱中静置抽提2 h，离心30 min（12 000 r/min，4℃）后所得上清液即为粗酶液。

1.3.2硫酸铵分级沉淀

向粗酶液中加入硫酸铵粉末至30%饱和度，4℃条件下盐析2 h，4℃、12 000 r/min离心30 min，弃沉淀收集上清液；往上清液中加入硫酸铵粉末至70%饱和度，4℃盐析1.5 h，4℃、12 000 r/min离心30 min，弃上清收集沉淀；将沉淀用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）溶解，再用10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）作透析液，于4℃冰箱中透析24 h后，即得初酶液。

1.3.3 DEAE-Sepharose离子交换层析

DEAE-Sepharose离子交换层析柱用50 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液（含1 mmol/L二硫苏糖醇）平衡好后，取8 mL初酶液上柱，用0～0.5 mol/L的NaCl溶液（用50 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制）进行线性梯度洗脱，流速0.5 mL/min，每管收集5 mL；测定各管ADH活力和蛋白质含量，收集活性较高的酶液，透析并冷冻干燥后保存备用。

1.3.4 Superdex-200凝胶过滤层析

Superdex-200层析柱用50 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液（含1 mmol/L二硫苏糖醇）平衡后，取在1.3.3节中收集的干燥后的样品，用双蒸水溶解后取3 mL上柱，用50 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液（含1 mmol/L二硫苏糖醇）缓冲液洗脱，流速0.3 mL/min，每管收集3 mL；测定各管ADH活力和蛋白含量；收集活性较高的几管酶液，4℃超纯水透析脱盐24 h，冷冻干燥后得到ADH纯品，并于-20℃冰箱保存备用。

1.3.5酶活力的测定

参照文献[13]方法（稍作改动）进行测定：ADH在催化乙醇转化为乙醛的同时，将辅酶NAD+还原成NADH，而NAD+和NADH各在260、340 nm波长处有最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的脱氢酶都可以通过测定340 nm吸光度的变化，定量测定酶的活力。本实验测酶体系包括：3 mL缓冲液（0.1 mol/L、pH 8.0的Tris-HCl）、0.4 mL 0.2 mol/L的乙醇、0.1 mL 4.5 mmol/LNAD+、80μL酶液。酶活力单位定义为：将A340nm在25℃、1 min内每变化0.001定义为一个活力单位（U）。

1.3.6猪肝ADH纯度鉴定及分子质量测定

通过SDS-PAGE法对1.3.4节中获得的酶活力较高管ADH进行纯度鉴定及亚基分子质量的测定，制备质量分数分别为5%的浓缩胶和12%的分离胶，上样量为10μL，经SDS-PAGE法测定ADH亚基分子质量。用凝胶层析法测定ADH全分子质量[14]。

1.3.7蛋白质含量的测定

采用紫外分光光度法与考马斯亮蓝（Bradford）法测定[14]。

1.3.8猪肝ADH部分酶学性质

1.3.8.1 ADH的最适温度和热稳定性

在pH 8.0条件下、不同温度（25～80℃）下测定ADH的酶活力，将酶活力最高值记为100%，计算各温度下的相对酶活力，以确定其最适反应温度。将酶液分别置于不同温度（25～75℃）下保温不同的时间后，测定ADH的酶活力，将不保温时测得的酶活力记为100%，计算温育不同时间下的相对酶活力，以研究该酶的热稳定性。

1.3.8.2 ADH的最适pH值和pH值稳定性

在45℃，不同pH值（4.0～10.6）的缓冲体系中测定ADH的酶活力，将酶活力最高值记为100%，计算各pH值条件下的相对酶活力，以确定其最适反应pH值。将酶液分别置于不同pH值的缓冲液中孵育2 h后分别测定其酶活力，将酶活力最高值记为100%，计算各不同pH值缓冲液孵育后酶液的相对活力，以研究该酶的pH值稳定性。

1.3.8.3 ADH米氏常数（Km）的测定

采用双倒数作图法[15]（Lineweaver-Burk法），以不同浓度（10～100 mmol/L）的乙醇作为底物，在45℃、pH 10.0最适反应条件下测定猪肝ADH的酶活力，求出猪肝ADH的Km值。

1.3.8.4不同有机溶剂对ADH活性的影响

将ADH酶液分别与等体积的不同体积分数的氯仿、甲醇、异丙醇、正丁醇混合并在常温下孵育20 min后，分别在最适反应条件（45℃、pH 10.0）下测酶活力，将等体积双蒸水稀释后酶液的活力记为100%，计算ADH的相对酶活力。

1.3.8.5不同化合物对ADH活性的影响

将ADH酶液分别与等体积的不同浓度的抗坏血酸、草酸、尿素、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、SDS混合并在常温下孵育20 min后，分别在最适反应条件（45℃、pH 10.0）下测酶活力，将等体积双蒸水稀释后酶液的活力记为100%，计算ADH的相对酶活力。

1.3.8.6部分金属离子对ADH活性的影响

将ADH酶液分别与等体积不同浓度的金属离子（Zn2+、K+、Co2+、Mg2+、Ag+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+）混合，在常温下孵育20 min后，分别在最适反应条件（45℃、pH 10.0）下测酶活力，将等体积双蒸水稀释后酶液的活力记为100%，计算ADH的相对酶活力。

2 结果与分析

2.1猪肝ADH的分离纯化

猪肝ADH初酶液经DEAE-Sepharose离子交换层析后结果如图1所示，该酶活力峰主要集中在10～18管，其中第14管酶活力最高，收集酶活性较高管的酶液，冷冻干燥后用于凝胶过滤层析，经Superdex-200凝胶层析，洗脱图谱如图2所示，酶活性峰主要集中在27～35管，其中第31管为酶活力最高峰，收集第31管酶液，用双蒸水透析24 h后冷冻干燥，通过SDS-PAGE电泳，显示为单一条带（图3），说明该酶经纯化后达到了电泳纯。该酶的整个分离纯化结果如表1所示，最终得到猪肝ADH的回收率为29.05%，纯化倍数为34.58，酶比活力为1 622.33 U/mg。

图1 猪肝ADH的DEAE-Sepharose层析图谱Fig.1 DEAE-Sepharose chromatography of ADH from pig liver

图2 猪肝ADH的Superdex-200层析图谱Fig.2 Superdex-200 chromatography of ADH from pig liver

表1 猪肝ADH的纯化结果Table1 Purification of ADH from pig liver

2.2 猪肝ADH的纯度鉴定及分子质量

纯化后的ADH经SDS-PAGE电泳显示为单一条带（图3），测得ADH亚基分子质量约为43.68 kD；用Superdex-200凝胶过滤层析测得全酶的分子质量为171.79 kD（图4），由此可以推断该酶由4个相同的亚基组成。

图3 猪肝ADH的SDS-PAGE图谱Fig.3 SDS-PAGE of ADH from pig liv er

图4 Superdex-200凝胶过滤层析测得的猪肝ADH分子质量Fig.4 Molecular weight estimation of ADH from pig liver by Superdex-200 gel filtration chromatography

2.3猪肝ADH的酶学性质

2.3.1 ADH的最适温度和热稳定性

图5 温度对猪肝ADH活力的影响Fig.5 Effect of temperature on the activity of ADH from pig liver

最适温度的实验结果如图5所示，25～45℃时，酶活力随温度升高而增加，当温度高于45℃酶活力随温度升高而下降，因此该酶最适温度为45℃，其温度作用范围广，在80℃条件下其相对酶活力仍保持在55.4%。温度稳定性的实验结果如图6所示，ADH在25～45℃范围内热稳定性较好，保温3 h后其相对酶活力也分别保持在99.2%、98.2%和86.2%；超过55℃保温后酶活力迅速下降，在65℃保温2 h酶活力完全消失，75℃保温1 h酶活力完全消失。

图6 猪肝ADH的热稳定性Fig.6 Thermal stability of ADH from pig liver

2.3.2 ADH的最适pH值和pH值稳定性

图7 pH值对猪肝ADH活力的影响Fig.7 Effect of pH on the activity of ADH from pig liver

如图7所示，该酶在pH 10.0时有最大活力，在pH 7.5时其相对酶活力达到95.5%。pH值稳定性实验结果如图8所示，纯化后的酶液在pH 7.5～9.0条件下孵育2 h后，酶活力均保持在较高水平（75%以上）；pH值小于7.0的酸性条件或pH值大于9.0的碱性条件下保存2 h其酶活力迅速下降。

图8 猪肝ADH的pH值稳定性Fig.8 pH Stability of ADH from pig liver

2.3.3 ADH的米氏常数（Km）

在45℃，pH 10.0条件下以不同浓度的乙醇作为底物，测定该酶活力，并采用双倒数作图法求得ADH的米氏常数，结果如图9所示，其Km值为19 mmol/L。

图9 双倒数法测定猪肝ADH的米氏常数图Fig.9 Kmdetermination of ADH from pig liver by Lineweaver-Burk plot

2.3.4不同有机溶剂对ADH活性的影响

图10 氯仿、异丙醇、甲醇、正丁醇对猪肝ADH活力的影响Fig.10 Effects of chloroform, isopropyl alcohol, methanol andn-butanol on the activity of ADH from pig liver

如图10所示，氯仿、异丙醇、甲醇、正丁醇4种有机溶剂对该酶均有较强的抑制作用，且随着有机溶剂体积分数越大其抑制作用越强，其中正丁醇对该酶抑制作用最为强烈，当体积分数达到20%时该酶活性完全丧失。

2.3.5不同化合物对ADH活性的影响

由图11a可知，SDS对该酶有很强的抑制作用，当浓度达到3 mmol/L时，酶几乎完全失活；EDTA对该酶活性的影响具有双重作用，低浓度时对该酶有一定的激活作用，当其浓度大于10 mmol/L时对该酶有一定的抑制作用；草酸和尿素对该酶具有抑制作用，且此作用会随着化合物浓度增高而增强；抗坏血酸对该酶的影响最小（图11b）。

图11 不同化合物对猪肝ADH活力的影响Fig.11 Effect of various compounds on the activity of ADH from pig liver

2.3.6部分金属离子对猪肝ADH活性的影响

通过实验发现，Ca2+、Mn2+、K+（图12a、12c）对该酶的活力影响不大；Mg2+对该酶有一定的激活作用（图12a）；Zn2+、Ag+、Cu2+、Fe3+、Co2+对该酶均有不同程度的抑制作用，其中Zn2+抑制作用最强，当其浓度达到0.4 mmol/L时酶活力已完全丧失，Ag+和Cu2+浓度达到0.5 mmol/L时该酶也彻底失活。

图12 不同金属离子对猪肝ADH活力的影响Fig.12 Effect of metal ions on the activity of ADH from pig liver

3 讨 论

本实验以猪肝为原材料，经分离纯化得到了电泳纯的ADH，利用此方法分离纯化ADH相较于已有研究具有以下优势：猪肝廉价易得、一年四季均可取材、纯化步骤简单、实验周期短、其回收率和纯化倍数高。相较于兔肝ADH[16]，本实验减少了DEAE-纤维素除杂蛋白及超滤步骤，但仍获得了电泳纯的ADH。

猪肝ADH最适温度为45℃，与柿果实[17]和醋酸杆菌[18]一致，高于酿酒酵母（37℃）[19]低于硬质小麦[20]（50℃）。该酶在80℃时相对酶活力为55.4%，相比于柿果实（60℃，完全失活）、蚕豆[21]（70℃，完全失活）、酿酒酵母[19]（45℃，活性急剧下降），其温度作用范围广。该酶在25～45℃条件下最为稳定，较醋酸杆菌（20～30℃）、酿酒酵母 （30～40℃），该酶热稳定性范围较大，较耐热。

pH 10.0时猪肝ADH活性最高，这与多数豆类[21]一致，与人血清ADH[22]（pH 9.0）接近，较莲雾[24]（pH 11.0）低，比蚕豆[21]（pH 8.7）高。该酶在pH 7.5和10.0均出现酶活峰，这与兔肝（pH 10.8和7.5）、松鼠猴（pH 10.8和8.2）类似。ADH的最适pH值不同可能与材料来源不同相关，如植物ADH的最适pH值多偏碱性，很多微生物如草莓中提取的扭脱甲基杆菌、葡萄杆菌[26]和醋酸杆菌[27]ADH的最适pH值均出现在酸性区域。

猪肝ADH亚基分子质量约为43.68 kD，与马肝[28]（44 kD）类似，高于栖热菌[29]（37.5 kD）、黄杆菌[30]（40 kD）、酒类酒球菌[31]（35 kD）。该酶对底物乙醇的Km值为19 mmol/L，与柿果实（8.33 mmol/L）、兔肝（3.0 mmol/L）、人血清[22]（3.03 mmol/L）、酿酒酵母（4.5 mmol/L）相比有较大差异，说明不同材料、不同组织来源的乙醇脱氢酶对底物的亲和力不同，可能是因为生物体为了能更好地适应环境，满足生长代谢的需求而表现出的生物特异性，这是生物体基因不断进化并选择性表达的结果[32]。

氯仿、异丙醇、甲醇、正丁醇均对该酶有抑制作用，可能原因如下：酶在有机溶剂环境中受到了扩散限制和立体障碍，使得酶与底物接触受到限制；该酶在有机溶剂中的构象发生了变化，酶只有当其分子本身具有一定构象时才有一定的催化活性，有机溶剂缺乏提供多种氢键的能力，而且由于它们的低介电常数往往会导致蛋白质带电基团之间更强的静电作用，使蛋白质的“刚性”更强，使其活性降低[33]。

不同金属离子对ADH活性影响有很大差异，Ca2+、Mn2+、K+对该酶活力影响不大；Zn2+、Ag+、Cu2+、Fe3+、Co2+对该酶均有不同程度的抑制作用，这与大多数文献的相关报道结果类似[23-24]，其中Zn2+、Ag+和Cu2+在低浓度下即可使酶完全失活，据悉此3种离子可与硫醇发生反应生成硫醇盐[34]，可能正是这一结构的变化影响了酶活性中心构象，导致酶失活；Mg2+对该酶有一定的激活作用，这与米根霉[35]和啤酒废酵母中Mg2+对该酶的抑制作用不同，这说明同种金属离子对不同来源的同一种酶的活性会产生不同的效应。

自1937年首次分离出乙醇脱氢酶以来，国内外对该酶的研究从未间断，对于多种来源的ADH的研究也已深入到分子水平，通过以上对于不同来源的ADH的各个性质进行比较，了解到不同来源的酶具有不同的生化性质，由此决定了其不同的实际用途。因此为了更好的开发和利用猪肝ADH，还有待在分子水平上对其进行深入研究。

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Isolation, Purification and Partial Characterization of Alcohol Dehydrogenase from Pig Liver

FU Ting, WANG Dan, WAN Ji, TANG Yunming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweetpotato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Electrophoresis-purity alcohol dehydrogenase (ADH) from pig liver was obtain ed through homogenization, buffer extraction, ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography and Superdex-200 gel fi ltration chromatography. Results showed that the specifi c activity of the purifi ed ADH was 1 622.33 U/mg with an activity recovery of 29.05% and a purifi cation fold of 34.58. The relative molecular weight of the ADH was approximately 171.79 kD, in which the subunit molecular mass was roughly 43.68 kD. The enzymatic properties showed that the optimum temperature and pH for the ADH were 45℃and 10.0, respectively. The enzyme was stable at 25–45℃and pH 7.5–9.0, and its apparentKmtowards ethanol was 19 mmol/L. The enzyme activity of ADH could be strongly inhibited byn-butanol, chloroform, isopropanol, sodium dodecyl sulfate, oxalic acid, Zn2+, Cu2+, and Ag+, and activated by Mg2+. EDTA had a dual effect on this enzyme.

pig liver; alcohol dehydrogenase; isolation and purification; enzymatic properties

Q946.5

1002-6630（2015）17-0179-06

10.7506/spkx1002-6630-201517034

2014-09-04

重庆市科委重点攻关项目（CSTC，2011AB1027）

傅婷（1990—），女，硕士研究生，主要从事蛋白质与酶工程研究。E-mail：futing3526@126.com

*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，主要从事蛋白质与酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn