染色体核型和单核苷酸多态性检测对AML预后评估的临床分析

2015-01-03戴强生陈志勇张铂龙健婷李鹤平

新医学 2015年11期

戴强生陈志勇张铂龙健婷李鹤平

临床研究论著

戴强生陈志勇张铂龙健婷李鹤平

目的探讨不同染色体核型及单核苷酸多态性（SNP）的急性髓系白血病（AML）患者、尤其是具有正常染色体核型患者预后的异同。方法应用G-显带技术和基于SNP的高分辨基因芯片（SNPa）对23例AML患者的骨髓进行检测，明确其染色体核型及SNP状况；观察患者的疾病转归，并分析患者疾病转归与其染色体信息变化的关系。结果在23例AML患者中，G-显带技术检测出11例伴有异常染色体核型，12例为正常染色体核型。SNPa检测出19例患者伴有基因信息异常，其中12例具有正常染色体核型的患者中有11例伴有SNP；这11例患者中有4例基因信息异常，表现为基因杂合性缺失（LOH）。12例具有正常染色体核型的AML患者中，有7例初次诱导即达完全缓解，经后续治疗存活至今；另有2例经再次诱导化学治疗后达完全缓解；还有3例初次诱导未达完全缓解，再次诱导化学治疗后因出现严重感染或内脏出血而死亡。11例具有异常染色体核型的AML患者中，有8例在初次诱导化学治疗后达完全缓解。经SNPa检测发现，23例AML患者中，5例具有LOH的患者有4例初次诱导不缓解可能与其合并有17或21号染色体长臂特定位点发生SNP有关。结论SNPa可作为染色体核型分析的补充手段，对AML患者，特别是具有正常染色体核型患者可提供更为准确的预后评估。

急性髓系白血病；单核苷酸多态性；染色体核型分型；基因杂合性缺失

急性髓系白血病（AML）是一类高度异质血液系统恶性肿瘤。异常的染色体核型对AML的诊断、分型、预后评估、治疗方案选择、疗效监测以及了解其生物学行为具有重要作用［1］。然而，大约50%的AML患者具有正常染色体核型，运用染色体核型分析预测AML预后无法应用于这一类患者［2］。因此，急需探寻另一种可发现这群患者间异同、并对其预后能做出评估的方法。单核苷酸多态性（SNP）作为第三代遗传诊断标记在疾病基因组学中具有重大意义。与传统技术相比，SNP芯片技术具有更高的分辨率，并且能够检测基因拷贝数不变的基因杂合性缺失（LOH）［3］。本文拟同时采用染色体核型分析技术及基于SNP的高分辨基因芯片（SNPa）检测23例AML患者的染色体信息变化，并探讨其疾病转归与染色体信息变化的关系。

对象与方法

一、研究对象

征得患者知情同意后，收集本课题各合作单位自2012年7月至2014年10月初治AML患者骨髓标本23例，同一患者骨髓标本分别用G显带技术和SNPa分析，同时用生理盐水预湿的棉签刮取其口腔黏膜细胞作为正常对照。参照张之南等主编的《血液病诊断及疗效标准》进行AML的亚型（M0-M7）分析，并结合多流式细胞术免疫分型、细胞遗传学特征及分子生物学特征进行综合判断［4］。

二、实验方法

1.G显带技术

将抽取的2 ml髂后上棘骨髓按MNC2×106／ml接种于肝素抗凝的1640培养基中，采用24 h短期培养法，培养终止前约3 h加入秋水仙素（终浓度为0.05 μg／ml），经低渗、固定后收获细胞，采用G显带法分析细胞核型，每个样本分析15～20个中期细胞。根据《人类细胞遗传学国际命名体制》进行描述，至少2个细胞有同样的染色体增加或结构重排，或3个细胞有同样的染色体丢失，方可确认为1个异常克隆。

2.SNPa检测

采用CytoScan 750K芯片（Affymetrix，USA）进行全基因组扫描，基本步骤如下：收集患者骨髓标本，采用QIAampDNAMiniKit（QIAGEN，USA）提取基因组DNA，经Nsp酶消化后以T4 DNA连接酶加入Nsp I接头后进行PCR扩增（TitaniumTaq DNA Polymerase，Clontech，USA），PCR产物经纯化、片段化、标记、杂交和洗染后于GeneChip Scanner 3000Dx进行扫描，结果于ChAs 2.0进行分析，染色体拷贝数变异描述依据ISCN 2013。

3.化学治疗方案

1例AML患者诱导化学治疗采用地西他滨＋CAG方案：地西他滨20 mg／m2，每日1次，d1-5；阿克拉霉素10 mg，每日1次，d3-6；阿糖胞苷10 mg／m2，每12 h 1次，d3-9；粒细胞集落刺激因子（G-CSF）300 μg，d1-9。1例AML患者诱导化学治疗采用DA方案：柔红霉素50 mg／m2，每日1次，d1-3；阿糖胞苷100 mg，每日2次，d1-7。其余患者均采用IA或MA方案方案诱导化学治疗。IA方案：伊达比星8～12 mg／m2，每日1次，d1-3；阿糖胞苷100 mg，每日2次，d1-7。MA方案：米托蒽醌8～12 mg／m2，每日1次，d1-3；阿糖胞苷100 mg，每日2次，d1-7。再次诱导化学治疗选用地西他滨＋CAG方案、MAE方案或FLAG方案。巩固化学治疗方案采用MA、IA或中大剂量阿糖胞苷，中大剂量阿糖胞苷：2～3 g／m2，每12 h 1次，d1、d3、d5。随访6个月以上患者均已接受自体或异基因造血干细胞移植。

4.随访

随访资料来源于住院、预约住院及门诊病历，自患者确诊之日起进行随访。依病历记录或对患者家属电话联系加以确认；存活病例随访至2015年7月15日。

结果

一、AML患者的一般情况

AML患者23例，其中M01例，M11例，M26例，M46例，M58例，M61例；男15例，女8例；中位年龄38岁；初诊时伴有高白细胞的患者3例；随访时间最长的AML患者为35个月，最短为1.5个月；其中病例3、4、12、13、15分别在确诊后3、1.5、1.5、3、4个月后因各种并发症而死亡，表1中所列随访时间除以上5例死亡病例外，均为其确诊后至今的时间。详见表1。

二、染色体核型情况

23例AML患者中染色体核型分析检测出11例伴有异常染色体核型（47.8%），其中病例3为复杂染色体核型；12例具有正常染色体核型（52.2%），见表2、3。

表1 23例AML患者的一般情况

表2 具有正常染色体核型AML患者的SNPa检测结果及其疾病转归

续表

表3 具有异常染色体核型AML患者SNPa检测结果及其疾病转归

三、SNPa检测AML患者基因信息改变情况

23例患者中SNPa检测出19例患者伴有基因信息异常（82.6%），其中12例具有正常染色体核型的AML患者中有11例伴有SNP；这11例患者中有4例基因信息异常表现为LOH，见表2。

四、染色体核型和SNP异常与AML患者疾病转归的关系

在23例AML患者中，15例患者在初次诱导后即达到完全缓解，其中17例患者目前仍处无病生存状态，其中随访至今的最长时间为35个月。11例合并异常染色体核型的AML患者有8例在初次诱导化学治疗后均达完全缓解，但病例3、9在后续随访中分别出现髓外和髓内复发；病例3因肺部感染而死亡，病例9在最近1次随访时出现疾病复发，后续疾病转归需进一步观察；病例13、16、23初次诱导化学治疗未达完全缓解，经再次诱导病例16、23达完全缓解，随访至今，仍无病生存；病例13经再次诱导化学治疗后疾病仍未缓解，后因髓内复发放弃治疗死亡。12例具有正常染色体核型的AML患者中，病例4、11、12、15、17经初次诱导化学治疗未完全缓解，且病例4、12、15因出现并发症而死亡，病例11、17后续疾病转归需进一步观察。经SNPa检测发现，23例患者中，具有LOH的5例患者有4例经初次诱导不缓解，仔细对比发现可能与其合并有17或21号染色体长臂特定位点发生SNP有关；且合并17号染色体长臂特定基因位点出现SNP的病例4、12、15患者均预后不良。SNPa检测发现伴有5号、7号染色体异常基因信息的病例9、13患者预后不良，这与传统染色体核型分析发现del5q、5q-、del7q、7q-预后相同。

讨论

急性白血病的预后与白血病细胞的免疫表型密切相关，但通过染色体核型分析细胞遗传学异常仍然是AML预后评估的最重要指标［5］。在非M3组AML中，参照染色体核型异常情况，美国国家癌症综合网（NCCN）按疾病预后风险不同分为3组：①良好组，包括t（8；21）、inv（16）和t （16；16）；②中等组，包括正常核型、单纯＋8、t （9；11）及其它预后良好和预后差组未提及的异常；③预后差组，包括复杂异常（＞3个异常）、-5、-7、5q-、7q-、除t（9；11）以外的11q23异常、inv（3）、t（3；3）、t（6；9）和t（9；22）［6］。本研究中，病例1、2、20均合并有预后良好的异常染色体核型，分别追踪随访35、30、7个月，患者仍呈无病生存状态；病例3具有复杂染色体核型表现，患者在确诊3个月后出现髓外复发；病例9染色体核型表现为5q-，确诊4个月后出现髓内复发。

正常染色体核型归为“中等组”，但其对治疗的反应以及疾病转归却具有高度异质性［7-8］。本研究中有12例AML患者具有正常染色体核型，5例初次诱导化学治疗不缓解，再次诱导化学治疗，其中3例因出现重症感染、内脏出血而死亡，余2例经2次诱导化学治疗后才获得完全缓解，但其随访时间较短，后续病情转归尚需进一步观察。目前无病生存者9例。这12例AML患者对治疗的不同反应及不同的病情转归，反映染色体核型在评估正常核型患者预后方面的局限性。

SNPa是基于全基因组水平扫描的一种技术，SNPa除可检测基因组拷贝数的变化之外，还能够检测到LOH和DNA倍数改变。这些改变也是肿瘤发生、发展的机制之一。本研究23例AML患者中，有19例被检测到存在SNP，且12例具有正常染色体核型的患者中有11例被检测到存在SNP。具有正常染色体核型的病例4、11、12、15、17初次诱导不缓解，用传统评估预后差的指标如高龄、初诊时高白细胞、具有复杂染色体核型或合并有NCCN归类为预后差的染色体核型等，这几例患者并不符合，究其初次诱导不缓解的原因，可能与其合并17号或21号染色体长臂特定位点发生SNP有关，其中病例4、11、17患者还存在染色体LOH。

综上所述，SNPa在染色体核型分析不能提供信息或不能揭示异常时可提供某些有价值线索［9］。然而其提供的某些线索也可能与疾病的诊断和预后并不相关，因此，在白血病的预后评估方面，其应被视为补充手段，而不应认为可以完全取代经典的染色体核型分析技术。

［1］Döhner H，Estey EH，Amadori S，Appelbaum FR，Büchner T，Burnett AK，Dombret H，Fenaux P，Grimwade D，Larson RA，Lo-Coco F，Naoe T，Niederwieser D，Ossenkoppele GJ，Sanz MA，Sierra J，Tallman MS，Löwenberg B，Bloomfield CD；European LeukemiaNet. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults：recommendations from an international expert panel，on behalf of the European Leukemia Net.Blood，2010，115（3）：453-474.

［2］Welch JS，Ley TJ，Link DC，Miller CA，Larson DE，Koboldt DC，Wartman LD，Lamprecht TL，Liu F，Xia J，Kandoth C，Fulton RS，McLellan MD，Dooling DJ，Wallis JW，Chen K，Harris CC，Schmidt HK，Kalicki-Veizer JM，Lu C，Zhang Q，Lin L，O＇Laughlin MD，McMichael JF，Delehaunty KD，Fulton LA，Magrini VJ，McGrath SD，Demeter RT，Vickery TL，Hundal J，Cook LL，Swift GW，Reed JP，Alldredge PA，Wylie TN，Walker JR，Watson MA，Heath SE，Shannon WD，Varghese N，Nagarajan R，Payton JE，Baty JD，Kulkarni S，Klco JM，Tomasson MH，Westervelt P，Walter MJ，Graubert TA，DiPersio JF，Ding L，Mardis ER，Wilson RK.The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.Cell，2012，150（2）：264-278.

［3］Costa AR，Vasudevan A，Krepischi A，Rosenberg C，Chauffaille Mde L.Single-nucleotide polymorphism-array improves detection rate of genomic alterations in corebinding factor leukemia.Med Oncol，2013，30（2）：579.

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［5］秘营昌，卞寿庚，薛艳萍，赵耀中，孟庆祥，郭亚林，李睿，秦铁军.急性髓细胞白血病免疫表型特点及与预后的关系.新医学，1997，6（4），194-195.

［6］Onsten T，Girardi FM，Coelho GM，Lima Frey MC，Paskulin G.Cytogenetic and morphological findings in 166 patients with de novo acute myeloid leukemia in southern.Cancer Genet Cytogenet，2006，170（2）：167-170.

［7］Foran JM.New prognostic markers in acute myeloid leukemia：perspective from the clinic.Hematology Am Soc Hematol Educ Program，2010，2010：47-55.

［8］Gregory TK，Wald D，Chen Y，Vermaat JM，Xiong Y， Tse W.Molecular prognostic markers for adult acute myeloid leukemia with normal cytogenetics.J Hematol Oncol，2009，（2）：23.

［9］Tiu RV，Gondek LP，O'Keefe CL，Huh J，Sekeres MA，Elson P，McDevitt MA，Wang XF，Levis MJ，Karp JE，Advani AS，Maciejewski JP.New lesions detected by single nucleotide polymorphism array-based chromosomal analysis have important clinical impact in acute myeloid leukemia.J Clin Oncol，2009，27（31）：5219-5226.

Clinical analysis of chromosome karyotype and single nucleotide polymorphism array in prognostic evaluation of acute myeloid leukemia

Dai Qiangsheng，Chen Zhiyong，Zhang Bo，Long Jianting，Li Heping.Department of Oncology，the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China

ObjectiveTo analyze G-banding karyotyping and single nucleotide polymorphism array （SNPa）method in evaluation of prognosis of acute myeloid leukemia（AML），especially for those with normal chromosome karyotype.MethodsG-banding karyotyping and SNPa analysis of the bone marrow from 23 AML patients were performed to detect the chromosome karyotype and SNP status.Clinical prognosis of those patients was observed and the relationship between clinical prognosis and alterations in chromosome genetic information was evaluated.ResultsAmong 23 AML patients detected by G-banding karyotyping，11 were accompanied with abnormal chromosome karyotype and 12 were normal.At the same time，SNPa analysis revealed that 19 patients showed abnormal genetic information and four were normal.Eleven of the twelve patients with normal chromosome karyotype were accompanied by SNP，four of whom presented with loss of heterozygosity（LOH）. Among 12 patients with normal chromosome karyotype，seven gained complete remission after the first chemotherapy induction，and still survived until now.Another two obtained complete remission following the second chemotherapy induction.Three patients failed to obtain complete remission after the first chemotherapy induction and died of severe infection or hemorrhage after the second chemotherapy induction.Among 11 patients with abnormal chromosome karyotype，eight obtained complete remission after the first chemotherapy induction. SNPa indicated that four patients with LOH failed to gain complete remission，probably caused by the occurrence of SNP in the specific sites of long arm of chromosome 17 or 21.Conclusion SNPa can serve as a com-plimentary tool in assessing the prognosis of AML，especially for those with normal chromosome karyotype.

Acute myeloid leukemia；Single nucleotide polymorphism；Karyotyping；Loss of heterozygosity

2015-08-06）

（本文编辑：杨江瑜）