Graves病患者外周血中树突状细胞及相关细胞因子的变化

吴 嘉,谢 谦,张宁波,毛吉炎,袁建辉*

(1.北京大学深圳医院内分泌科,广东深圳518036;2.深圳市疾病预防控制中心)

Graves病患者外周血中树突状细胞及相关细胞因子的变化

吴 嘉1,谢 谦1,张宁波1,毛吉炎2,袁建辉2*

(1.北京大学深圳医院内分泌科,广东深圳518036;2.深圳市疾病预防控制中心)

目的 检测Graves病人外周血细胞因子和树突状细胞(DCs)不同亚群的数量和表达情况,初步探讨DCs细胞亚群在疾病中的作用。 方法 利用流式细胞仪检测30例Graves病患者和30名健康体检者的外周血树突状细胞亚群数量,同时利用ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)及IL-6等细胞因子的水平。 结果 测得Graves组髓样树突状细胞(pDC)和浆细胞样树突状细胞(mDC)值均高于正常对照组。ELISA检测细胞因子发现,Graves患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平均高于正常对照组,其中TNF-α显著升高(P＜0.01),而IL-2水平显著低于对照组(P＜0.01)。 结论 Graves病人中pDC和mDC水平升高,细胞因子分泌失调,Th1/Th2失衡,从而导致机体自身免疫反应的产生。

Graves病; 树突状细胞; 细胞因子

格雷夫斯病(Graves'disease,GD)又称毒性弥漫性甲状腺肿,是最常见的自身免疫性甲状腺疾病(ATID)[1]。树突状细胞(DC)是目前已知的体内功能最强的专职性抗原提呈细胞,根据其表面标记,可将其分为髓样树突状细胞(mDC)和浆细胞样树突状细胞(pDC),他们可以激活初始的T淋巴细胞向Th1、Th2细胞分化。本研究采用流式细胞仪技术检测Graves病血液中mDC、pDC的变化,并用ELISA检测TH1、TH2相关的细胞因子,以探索DC细胞亚群与TH1/TH2细胞失衡的关系,初步研究DC细胞在Graves疾病发生中的作用。

1 资料与方法

1.1 主要仪器和试剂

流式细胞仪BD FACSArial,淋巴细胞分离液,荧光抗体,pDC标记试剂:(CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD33-PCS;mDC标记试剂:(CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD123-PC5;鞘液、溶血素、HUMAN TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6 ELISA KIT 等。

1.2 一般资料

收集本院2013年5月～2014年2月门诊及住院Graves病患者30例(均无其他自身免疫性疾病,1年内没有使用过免疫抑制剂),其中男性14例(46.7%),女性16例(53.3%);平均年龄42.6岁。另选同期30例年龄和性别匹配的健康志愿者作为正常对照组,男女各15例(50%),平均年龄为41.8岁。两组的平均年龄、性别的差异无统计学意义(P＞0.05)。研究经医院批准并在开始前均获得研究对象的知情同意。

1.3 外周血单个核细胞(PBMC)的分离

取研究对象的抗凝静脉血5 mL,1 000 r/min离心10 min,留取血清后再用等体积的PBS液稀释1倍,加入淋巴细胞分离液,密度梯度离心,3 000 r/min离心20 min,收集单核细胞层于15 mL离心管中,用PBS液洗涤2次,得到PBMC,用血球计数板计数。

1.4 DC比例检测

取200μL PBMC细胞悬液分别加入荧光抗体(CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD33-PCS和CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD123-PC5;另取200μL PBMC细胞悬液加入FITC-mouse IgG和PE-mouse IgG混匀后室温避光放置30 min;每管加入2 mL PBS混匀后洗涤3次,再加入1 mL PBS重悬,流式细胞仪检测pDC和mDC占淋巴细胞的比例。

1.5 细胞因子检测

分离Graves组和正常对照组血清,利用ELISA检测试剂盒分别检测 TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6 细胞因子水平,具体实验步骤按ELISA检测试剂盒说明书进行。最后利用酶标仪检测492 nm处吸光度(OD)。根据标准曲线测出样品中各个细胞因子的浓度。

1.6 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件进行分析,数据均以表示。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One Way ANOVA)。进一步进行组间两两比较时,采用SNK检验。

2 结 果

2.1 两组外周血pDC和mDC水平的比较

利用流式细胞仪检测Graves组和正常对照组外周血单核细胞中pDC及mDC亚群水平变化,结果见表1。与正常对照组相比,Graves组pDC和mDC水平均显著性升高(P＜0.01)。

表1 Graves组与正常对照组DC亚群在外周血单核细胞的比例_____________________________________________

2.2 血清细胞因子水平检测

酶联免疫检测Graves组和正常对照组细胞因子的浓度,结果见表2。检测结果可以发现Graves组血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-6细胞因子均高于正常对照组,其中TNF-α显著升高了2.7倍(P＜0.01),而IL-2显著低于正常对照组(P＜0.01)。

表2 Grave组与正常对照组血清中细胞因子浓度的比较(pg/mL)

3 讨 论

Graves病是一种伴甲状腺激素分泌增多的器官特异性自身免疫病,其发病机理十分复杂,细胞免疫和体液免疫紊乱均与GD免疫病理形成密切相关。目前研究表明:多种免疫细胞、细胞因子和miRNA共同参与了GD发病机制,尤其是T淋巴细胞、DC细胞及其相关因子[2-3]。

树突细胞是人体内最强的抗原提呈细胞,根据细胞表型常分为mDC和pDC两亚群,mDC为CD14+、CD16+、CD33+、D85K+,主要发挥抗原提呈的功能,促进细胞免疫的发生,mDC是人体主要的抗原提呈细胞(APC),激活体内T淋巴细胞,同时参与初始(native)T细胞的活化,在特异性免疫应答中发挥重要作用;pDC为CD14+、CD16+、CD123+、D85K+,主要产生干扰素TFN-α,促进体液免疫的发生[4]。pDC除有较弱的APC功能外,在人体受到病毒攻击时pDC还可以产生大量干扰素,抑制病毒复制和增强人体免疫功能,从而在天然的免疫应答过程中发挥重要作用[5]。本实验通过流式细胞仪分别检测(CD14+、CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD33-PCS和(CD14+、CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD123-PC5,得到病患者血液中pDC和mDC在淋巴细胞中的比例,结果表明两者均高于正常对照组,说明Graves病即与体液免疫有关,又受到细胞免疫的影响。目前关于许多研究都表明DC细胞与多种病病的发生有关[5-6],如:红斑狼疮、哮喘等等。

此外本研究通过ELISA检测Grave病患者血清细胞因子,发现 TNF-α、IFN-γ、IL-6 显著升高,而 IL-2显著降低(P＜0.01)。这些细胞因子主要是辅助T细胞产生具有多种生物学活性的蛋白质或肽类,他们通过与各目的靶细胞表面特异性受体结合发挥作用[7]。Th1细胞激发迟发型超敏反应,介导细胞免疫应答,主要分泌 IL-2和 IFN-γ细胞因子[8]。Th2细胞促进抗体产生,介导体液免疫应答,主要表达IL-4、IL-6、IL-10等细胞因子[9]。 ELISA 检测Grave病患者IL-6水平升高,说明Th2介导的免疫应答在GD发病的有重要作用。此外检测Graves病患者TNF-α细胞因子明显升高,可能是pCD细胞增加引起的。IL-2显著性降低,表明Th1介导细胞免疫应答在Graves病发生作用较小,同时发现IFN-γ有所升高,但没有明显差异,IFN-γ主要是由Th1细胞和NK细胞产生[10]。不同的淋巴细胞产生相同细胞因子,同一种淋巴细胞可以产生多种细胞因子,这些细胞因子间有着非常复杂的相互调节作用,淋巴细胞及细胞因子间构成了复杂的免疫调控网络[11-12]。免疫调控网络失调导致自身免疫紊乱引发Graves病。

综上所述,Graves病人中pDC和mDC水平升高,细胞因子分泌失调,Th1/Th2失衡,从而导致机体自身免疫反应的产生。

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The Changes of the Peripheral Blood Dendritic Cells and Some Related Cytokines in Graves'Disease Patients

WU Jia,XIE Qian,ZHANG Ningbo,et al
(Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen,Guangdong 518036,China)

Objective To discuss the role of DC cells in Graves disease,we detect the frequency of different DC subsets and the secretion of cytokines in Graves patients'peripheral blood. Method Flow cytometry(FCM)was performed to assess the frequency of different DCsubsets in peripheral blood of 30 Graves patients and 30 healthy cases respectively.And ELISA was applied to detect the secretion of TNF-α,IFN-γ,IL-2 and IL-6 and other cytokines in the peripheral blood. Results The frequency of pDCs and mDCs in Graves disease group was higher than that in healthy cases.And ELISA results showed that the secret of TNF-α,IFN-γ and IL-6 in Graves disease patients'peripheral blood were significant higher than that in normal control group,while IL-2 were significantly lower than the control group(P＜0.01).Conclusion The frequency of pDCs and mDCs in Graves disease were higher than that of healthy controls,which indicated that pDC and mDC were involved in the pathogenesis of Graves.

Graves'disease; dendritic cells; cytokine

R581.3

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.008

2014-09-19;

2015-02-15

深圳市科技计划项目(201201028,201203029);深圳市科技研发资金项目(JCYJ20120615085512920,JCYJ20140410164217365,ZYC201006180477A).

*通讯作者,E-mail:jianhui_yuan@126.com.

(此文编辑:朱雯霞)