朊蛋白在头颈部鳞状细胞癌中的表达及意义

田甜，徐江，邱雪冰

（石河子大学医学院第一附属医院口腔科，石河子 832000）

头颈部鳞状细胞癌 (head and neck squamous cell carcinomas，HNSCC)泛指发生于口腔颌面部，咽喉及上呼吸消化道等部位的鳞状细胞癌。它是头颈部恶性肿瘤的主要病理类型，约占头颈部恶性肿瘤的95%[1-2]。HNSCC居于所有癌症病死率的第六位，全世界每年新发病例50万[3]，HNSCC的发病率有明显增长趋势，严重威胁着人类的健康和生命。HNSCC具有影响患者进食、致颌面部组织缺损、高发病率、低生存率等特点[4]。朊蛋白（prion protein，PrP）与恶性肿瘤的发生、发展、转移、耐药性等密切相关[5]，此外还有研究发现PrP可能以通过上调抗凋亡蛋白（Bcl-2）表达并抑制凋亡前体蛋白(Bax)基因、p53和细胞色素C，发挥抗凋亡的作用[6]。研究发现PrP的高表达在胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤的发生、发展中角色十分重要[7-10]。本课题探讨了PrP在HNSCC的发生、发展、转移中的作用，以期寻找HNSCC早期诊断、预后判断的分子指标。

1 资料与方法

1.1 一般材料

收集1993-2013年新疆维吾尔自治区石河子大学医学院第一附属医院口腔颌面外科及耳鼻咽喉科经手术切除、病理诊断明确且病历资料完整的HNSCC标本212例。HNSCC病例中，年龄14～93岁，平均 59.49±14.20岁；口腔 96例，鼻咽部 59例，喉部57例；高分化67例、中分化69例、低分化76例；淋巴转移103例、淋巴无转移109例。212例患者按1997年UICC临床分期分组，其中Ⅰ期60例、Ⅱ期47例、Ⅲ期62例、Ⅳ期43例；Ⅰ+Ⅱ期为早期组，Ⅲ+Ⅳ期为晚期组。同时手术中收集头颈部正常黏膜标本84例，其中口腔30例，鼻咽部21例，喉部33例（患者知情同意）。

1.2 主要仪器与试剂

PrP WH2鼠抗人单克隆抗体由中国科学院武汉病毒研究所病毒学李朝阳实验室提供；相关试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

组织标本经福尔马林固定，石蜡包埋，制成4 μm厚的切片。经烤片、脱蜡、脱二甲苯、脱水后，再将切片放人3%甲醇双氧水中封闭10 min以灭活内源性过氧化物酶；清水冲洗后微波抗原修复20 min；pH为7.3的磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline，PBS)振洗后滴加一抗（对照组滴加PBS），放人4℃冰箱24 h。PBS振洗后滴加第二抗体，37℃恒温箱孵育30 min；再次振洗后滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶孵育30 min，DAB显色、苏木素复染。结果在光学显微镜下观察。

1.4 结果判定

染色背景清晰，PrP定位于细胞的胞质或胞核中，间质无染色。以镜下组织胞质或胞核中出现棕色或者棕黄色染色为阳性标准，并由2位病理学专家根据相应评分标准赋值，其评分标准如下：着色强度分为4个等级：无着色计0分、浅棕黄色计1分、棕黄色计2分、棕褐色计3分。阳性细胞所占比例分为五个等级：百分比＜5%计0分、6～25%计1分、26～50计2分、51～75%计3分、76～100%计4分。

本研究结合阳性细胞百分比及着色强度分数相乘后分级，所得分数为0～1分时，分级为（-）；2～4分为（+）；5～8分为（++）；9～12分为（+++），其中 -为阴性组、+为弱阳性组、++/+++为强阳性组。

1.5 统计学方法

运用SPSS 17.0软件，选择非参数检验中的Mann-Whitney检验方法及Kruskal-Wallis检验方法分析PrP的表达强度与HNSCC患者临床参数之间的相关性；并选择χ2检验或Fisher's精确检验分析正常黏膜与HNSCC之间的表达差异及各亚组之间的表达差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 PrP在正常黏膜和HNSCC中的表达

PrP在正常黏膜和HNSCC中的表达情况见图1。

图1 免疫组化PrP在HNSCC不同部位及正常粘膜的表达情况Fig.1 Expression of PrP in HNSCC and normal mucosa

PrP在各组织表达主要定位于胞质中，并在各分型之间无明显差异；染色呈棕黄色，同时PrP在肿瘤组织中呈高表达状态（图1）。

84例正常黏膜组织中有9例呈阳性表达，阳性率为10.71%；212例HNSCC中有141例呈阳性表达，阳性率为66.51%，显著高于正常黏膜(χ2=74.930，P=0.000)，差异有统计学意义。

2.2 PrP的表达强度与相关临床参数的关系

PrP的表达强度与相关临床参数的关系见表1。

表1 PrP在HNSCC中的表达与临床参数的关系Tab.1 The PrP between the expression levels and clinical parameter in HNSCC

由表1可知：

(1)发生部位：PrP在不同部位的阳性表达率为口腔 94.79%(91/96)，鼻咽部 28.81%(17/59)，喉部 57.89%(33/57)，PrP在鼻咽部的阳性表达较之口腔和喉部偏低，差异具有统计学意义(χ2=73.884，P=0.000)。

(2)淋巴结转移：PrP在淋巴结转移组和未转移组中的阳性表达率分别为54.37%(56/103)和77.98%(85/109)，PrP在淋巴结转移组的阳性表达较之未转移组偏低，差异有统计学意义(Z=-2.319，P=0.020)。

(3)正常黏膜、不同分化HNSCC组织：PrP在正常黏膜、高分化、中分化及低分化HNSCC组织中的阳性表达率10.71%(9/84)和66.51%(141/212)，随着分化程度下降而升高。同时PrP表达强度也随病理分级下降而增强，差异具有统计学意义(χ2=51.670，P=0.000)。

(4)年龄：PrP在45岁以下，45-65岁和66岁以上患者HNSCC中阳性表达率分别为59.46%(22/37)、60.44%(55/91)和76.19%(64/84)，差异无统计学意义(χ2=4.733，P=0.094)。

(5)TNM分期：Ⅰ期60例、Ⅱ期47例、Ⅲ期 62例、Ⅳ期43例，分期之间差异有统计学意义（χ2=12.103，P=0.007），PrP表达强度随 TNM分期分级下降而增高；Mann-Whitney检验分析得出PrP在Ⅰ、Ⅱ期中表达的渐进性增强具有统计学意义(Z=-2.337，P=0.019)，但 PrP在Ⅲ、Ⅳ期中表达的渐进性增强不具有统计学意义(Z=-0.265，P=0.791)；同时Fisher's精确检验得出正常粘膜，早期组Ⅰ+Ⅱ期(58/107)和晚期组Ⅲ+Ⅳ期(83/105)表达差异也具有统计学意义(χ2=93.362，P=0.000)（表2、表3）。

表2 PrP在Ⅰ期和Ⅱ期中的渐进性增强表达的差异Tab.2 Difference of progressive expression of PrP betweenⅠand Ⅱ TNM stages

表3 PrP在正常黏膜，Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期中的表达的差异Tab.3 Difference of progressive expression of PrP in normal mucosa，Ⅰ+ⅡandⅢ+Ⅳ TNM stages

3 讨论

我国HNSCC（包括喉癌、鼻咽癌、口腔鳞癌等）的发病率已占头颈部肿瘤的第1位，且逐年呈上升趋势[11-13]。但在HNSCC中，特别是晚期肿瘤的患者五年生存率并没有明显提高[14]，而HNSCC的发生发展是一个长期、多阶段过程，至今机制尚不清楚，所以能否找到HNSCC早期诊断及预后至关重要。

本研究通过免疫组化技术检测PrP在正常黏膜和HNSCC组织中的表达，探讨其表达差异及临床意义。结果表明，PrP在以上组织中均表达于细胞质，同时肿瘤组织的阳性率66.51%(141/212)显著高于正常黏膜10.71%(9/84)，说明PrP与头颈部的发生发展过程有关。PrP在不同部位，淋巴转移，病理分期，TNM分期间的差异都有统计学意义；在年龄间的差异无统计学意义。PrP在不同部位的阳性表达率为口腔94.79%(91/96)，鼻咽部28.81%(17/59)，喉部57.89%(33/57)，差异具有统计学意义(P<0.05)，且PrP在鼻咽部的阳性表达较之口腔和喉部偏低，可能是鼻咽部的鳞状细胞癌中某种其他机制导致PrP的表达下调所致，有待进一步研究。

在HNSCC中对于淋巴结转移情况，口腔鳞状细胞癌因上颌血运较下颌丰富、舌体活动多促进转移的发生，引起下唇和下颌牙龈癌的早期转移较上唇和舌癌少。另外，口腔颌面部的鳞状细胞癌因其较早能够被发现并治疗，所以某些中低分化的下唇及牙龈癌染色强度高但并未出现淋巴结转移；而舌体、舌根、口咽及上唇癌虽然是高分化型，但已发生转移。以上因素共同作用导致PrP在淋巴转移组较之为未转移组阳性表达率低。PrP随着病例分化和临床分期程度的下降而出现表达增强的趋势。

病理分型中PrP表达强度随分化下降而升高，高分化较中低分化鳞状细胞癌染色范围稍广，但着色强度较之变浅，这之间的不同可能与肿瘤组织的异型性和癌巢形成有关，同时有1例低分化鳞状细胞癌出现了阴性表达，可能是PrP在低分化分型中被某种酶或物质转化成为另外一种形式或进入胞核未能检测到，而这一推论是否成立也有待进一步研究。临床TNM分期中，Ⅰ、Ⅱ期肿瘤的PrP表达强度随分化下降而升高(P<0.05)，但与Ⅲ、Ⅳ期的差异并不具有统计学意义(P>0.05)；而在正常黏膜，Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ期的总体表达差异中具有统计学意义(P<0.05)，PrP成渐进性表达增高，说明PrP在Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ整体分期中，随着分期程度下降出现表达增强的趋势，可见PrP在HNSCC的发生发展过程中占有重要的作用。

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