针刺联合紫杉醇对小鼠Lewis肺癌代谢的影响

赵宏亮，成泽东，李春日，张小卿，张志星，陈以国（辽宁中医药大学，沈阳110032）

针刺联合紫杉醇对小鼠Lewis肺癌代谢的影响

赵宏亮，成泽东，李春日，张小卿，张志星，陈以国*通信作者：陈以国，男，博士，教授，电话－15998839950
（辽宁中医药大学，沈阳110032）

目的 观察针刺对体内药物代谢和药物分布的影响，探讨针刺特定穴位对靶器官药物含量的影响。方法 把雌性A/J系小鼠288只随机分为4组，每组72只，并建立模型，采用诱发小鼠肺鳞状细胞癌造模法，分别采用针刺、药物及针药结合法对其进行治疗，对不同时间内，不同组内的小鼠分别进行药物浓度注射，处理后，提取相关脏器，采用高效液相色谱仪测定各组织器官（肺脏、肝脏、心脏）的紫杉醇浓度。结论 针刺特定穴位能增加靶器官药物含量，提高疗效。

针灸疗法；紫杉醇；趋向性；肺癌；小鼠

肺癌是发病率和病死率增长最快，对人类的健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。常选紫杉醇（Paclitaxel Taxol，太平洋紫杉醇）中药为治疗癌症的有效药物，但是因其在临床出现多种毒副反应，如过敏反应，骨髓抑制，神经毒性等，故临床对紫杉醇的使用多加以限制［1-3］。本实验研究针刺对体内药物代谢和药物分布的影响，探索针刺特定穴位对靶器官药物含量的影响，证实针刺“肺俞”可增加紫杉醇在小鼠肺脏及瘤体内的含量，促进肿瘤细胞凋亡，提高治疗效果［4-6］。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级7周龄，雌性A/J系小鼠288只，体质量为（20±2）g，中国医学科学院实验动物中心提供［合格证号：（北）2012-0003］。

1.2 主要试剂及仪器 紫杉醇标准品：上海思莱克实验动物中心生产；紫杉醇注射液：四川升和制药有限公司生产，浓度为30mg/5mL；Lewis肺癌可移植性瘤株：中国医科大学免疫教研室生产；乙腈、甲醇，均为色谱纯，其他试剂均为分析纯：四川升和制药有限公司生产；HeraeusB iofuse 28RS低温高速离心机（四川升和制药有限公司）；DY89-1型电动玻璃匀浆机（上海诺顶仪器设备有限公司）；KQ-100型医用超声波清洗器（上海超声波仪器厂）；LC-10AT高效液相色谱仪（北京京科瑞达科技有限公司）；SPD-10AT可见-紫外检测器（北京康蒂尼药业有限公司）；C-R3A数据处理机（日本岛津公司）；0.25mm×30mm针灸针（苏州医疗用品厂）。

1.3 动物分组及造模

1.3.1 动物分组 288只小鼠随机分为4组，每组72只。紫杉醇药物组：腹腔注射紫杉醇；针刺肺俞组：腹腔注射紫杉醇同体积生理盐水，针刺“肺俞”穴。针刺灵台组：腹腔注射紫杉醇同体积生理盐水，针刺“灵台”穴。针刺肺俞、灵台加紫杉醇药物组：腹腔注射紫杉醇，针刺“肺俞”和“灵台”穴。

1.3.2 动物造模 采用 NTCU（N-nitroso-trischloroethylurea）诱发小鼠肺鳞状细胞癌造模法。具体方法：室温控制在（21±2）℃，空气定期用紫外线消毒，垫料用高压进行灭菌。动物自由饮水和摄食，饮冷开水，用每日新鲜蒸热的标准混合饲料。小鼠背部刮毛，采用NTCU（溶解于丙酮）涂抹小鼠背部皮肤，25μL（0.04mmol/L NTCU），2次/周，每周刮毛1次，第8个月造模结束。组织学检查确认造模成功。

1.4 处理因素

1.4.1 针刺治疗 时间：给药前针刺。选穴：针刺肺俞组、灵台组，其中含有“肺俞”的穴位连双侧电（电流经体表通过，不经过心脏，预实验无不良反应），含有灵台穴配非经非穴（灵台外下1 cm处），以上穴位选取参照全国针灸学会实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴位图谱》取穴。方法：顺经以30°角斜刺，刺入皮下2 mm，连电极，接6805-A型电针仪，施以疏密波，频率2 Hz，强度2～4mA，留针15min。1次/d，连续5次。空白组、模型对照组和紫杉醇药物组均与施加因素组同样捆绑在小鼠固定架上。

1.4.2 药物治疗 时间：最后1次针刺后立即给药。根据人临床推荐用量及不同种属之间药物剂量的换算法，确定小鼠的给药剂量为紫杉醇6 mg/kg，将紫杉醇注射液用生理盐水稀释至0.6mg/mL，腹腔注射给药。

1.5 取材及样品制备

1.5.1 血浆高效液相样品 给药后15、30 min，分别于1、2、8、12、24 h取5只小鼠异氟醚麻醉，心脏穿刺放血处死，置肝素化塑料离心管中，离心5 000 r/min，离心5 min，分离血浆。取血浆100μL加入内标多烯紫杉醇（Docetaxel）25μL（1μm），醋酸铵 750μL （10 mmol/L醋酸铵溶于乙腈），涡 旋 混 合，离 心10 000 r/min，离心10min，取上清0.2μm注射器过滤器过滤，用流动相溶液补足最终体积为1 mL，取20μL供血药浓度测定。流动相溶液组成：65％乙腈，35％ 10 mmol/L醋酸铵。

1.5.2 肺脏、心脏、肝脏组织高效液相样品 给药后15、30 min，分别于1、2、8、12、24 h取5只小鼠异氟醚麻醉心脏穿刺放血处死，各脏器取样称重，加入等体积蒸馏水研磨，取上清100μL加入内标多烯紫杉醇25μL（1μm），醋酸铵750μL（10 mmol/L醋酸铵溶于乙腈），涡旋混合，离心10 000 r/min，离心10 min，取上清0.2μm注射器过滤器过滤，用流动相溶液补足最终体积为1mL，取20μL供药物浓度测定。

1.5.3 肺脏、心脏、肝脏组织免疫印迹样品 给药后15、30min，分别于1、2、8、12、24 h取5只小鼠异氟醚麻醉心脏穿刺放血处死，取样称重，各脏器取样液氮冷冻研磨，RIPA裂解液提取总蛋白。

1.6 定量分析紫杉醇浓度 高效液相色谱仪绘制标准曲线、考察日内精密度和日间精密度、回收率测定 色谱条件：色谱柱：DiamonsilTMC18（150 mm× 4.6mm，5μm）；流动相：65％乙腈，35％10 mmol/L醋酸铵；柱温：40℃；检测波长：230 nm；流速：100μL/min。高效液相色谱仪测定各样品的紫杉醇浓度。药物代谢动力学及统计学数据处理使用DAS软件确定药物代谢动力学模型，计算血浆和各脏器组织药代动力学参数；使用SPSS 19.0统计学分析药代动力学参数。

2 方法学评价

经线性范围考察、精密度实验考察、稳定性实验考察、重复性试验考察、回收率试验考察，结果提示各项试验均符合有关规定。

3 实验结果

3.1 紫杉醇在 Lewis肺癌小鼠体内肺组织中的含量 见表1。注射紫杉醇后各实验组肺组织中的药物含量均在2 h时最高，而针刺肺俞穴或灵台穴或同时针刺两穴。可使药物含量在不同时间点有不同程度的升高，以同时针刺肺俞穴和灵台穴作用最为明显。

表1 腹腔注射后不同时间点各实验组肺组织中药物含量（±s，n＝72） μg/mL

表1 腹腔注射后不同时间点各实验组肺组织中药物含量（±s，n＝72） μg/mL

注：与药物组比较，＃P＜0.05；与灵台组比较，△P＜0.05；与肺俞组比较，▲P＜0.05

组别1 h 2 h 3 h紫杉醇药物组 32.33±2.46 33.63±3.51 31.16±2.78针刺肺俞组 37.83±3.64＃ 39.35±3.41＃ 33.27±3.13＃针药灵台组 35.16±3.31＃ 37.26±3.67＃ 30.31±3.53＃针药肺俞灵台组 40.02±3.43＃△ 42.36±3.03＃△▲37.59±3.21＃△▲

3.2 紫杉醇在 lewis肺癌小鼠体内肝组织中的含量 见表2。药物组肝组织中的紫杉醇含量在注射后，2 h达到高峰，之后含量逐渐下降；3个针药组肝组织中药物含量在3个时间点呈逐渐上升趋势，其药物含量变化与药物组明显不同。

表2 腹腔注射后不同时间点各实验组肝组织中药物含量（±s，n＝72） μg/mL

表2 腹腔注射后不同时间点各实验组肝组织中药物含量（±s，n＝72） μg/mL

注：与药物组比较，＃P＜0.05

组别1 h 2 h 3 h紫杉醇药物组 16.53±4.01 27.05±3.32 16.42±3.61针刺肺俞组 14.93±4.72 17.96±4.56＃ 22.36±3.97针药灵台组 13.89±3.89 16.88±4.26＃ 23.65±4.61＃针药肺俞灵台组 15.58±4.62 18.36±3.97＃ 21.56±3.82＃

3.3 紫杉醇在 lewis肺癌小鼠体内心组织中的含量 见表3。各实验组在不同时间点心组织中紫杉醇的含量均呈下降趋势，其中以药物组最为明显，2个针药组下降缓慢。

表3 腹腔注射后不同时间点各实验组心组织中药物含量（±s，n＝72） μg/mL

表3 腹腔注射后不同时间点各实验组心组织中药物含量（±s，n＝72） μg/mL

注：与药物组比较，＃P＜0.05；与针药灵台组比较，△P＜0.05

组别1 h 2 h 3 h紫杉醇药物组 24.36±3.65 17.68±3.41 11.86±3.30针刺肺俞组 14.78±2.96＃ 9.36±3.11＃ 5.61±3.32＃针药灵台组 15.63±2.78＃ 8.25±2.67＃ 2.35±2.97＃针药肺俞灵台组 13.69±3.01＃ 10.87±3.64＃ 8.93±2.69＃△

3.4 腹腔注射紫杉醇后1 h各实验组不同组织中的药物含量比较 在注射药物1 h后，针药肺俞灵台组肺组织中紫杉醇含量明显高于其他3组，3个针药组脾、肝组织中药物含量明显低于药物组，而肝组织中药物含量与药物组相比无统计学意义。见图1。

3.5 腹腔注射紫杉醇后2 h各实验组不同组织中的药物含量比较 腹腔注射药物2 h后，针药组的肺组织中的紫杉醇含量明显高于药物组，其中以肺俞、灵台组最为明显；同时，3个针药组肝、心组织中的药物含量明显低于药物组。见图2。

3.6 腹腔注射紫杉醇后8 h各实验组不同组织中的药物含量比较 针刺肺俞组在注射药物8 h后肺组织中的紫杉醇含量仍高于药物组，3个针药组肝组织中药物含量开始明显升高，心组织中的药物含量开始明显降低。见图3。

4 讨论

通过观察药物在小鼠体内的分布浓度，可以发现针刺联合紫杉醇药物组在脏器中的浓度明显高于非针刺的药物组的浓度。这体现针刺某些特定穴位，或配穴能够使药物趋向于特定的器官，从而产生靶向性或靶向作用，使药物能充分利用，有效控制药物的趋向性，使药物能够有针对的治疗特定器官，减少毒副作用。实验表明，针刺“肺俞”配合“灵台”穴使紫杉醇更有效的到达特定部位，增加相应靶性器官内的药物浓度，从而提高疗效［5-6］。

图1 各实验组在1 h时不同组织中的药物含量

图2 各实验组在2 h时不同组织中的紫杉醇含量

针灸在传统经络理论当中有扶正祛邪的作用，在现代研究当中针灸有调整和增强机体免疫功能的作用，其机制主要是针刺可通过穴位的外周感觉神经或交感神经、副交感神经等的传入，进而调节机体的免疫功能。通过针灸作用与药物的双向治疗作用及与针刺的靶向作用使二者发挥了协同、增效的作用。

本实验从三个方面证明了针刺有靶向性：其一是针刺“肺俞”“灵台”穴影响了紫杉醇在体内的代谢，使药物在各脏器的分布发生明显变化；其二是给药后观察1～3 h的药物浓度表明针刺“肺俞”加“灵台”穴更能增加在肺脏的药物浓度分布，且明显高于其他药物和针刺组；其三是针刺显著影响了紫杉醇的肝脏分布和代谢。肺俞、灵台两穴均位于背部，属肺脏在体表投影的范围内，针刺两穴可直接促进局部的气血运行，从而使到达肺脏的药物含量增加［7-10］。另外，穴位对相应脏腑的调整具有特异性，此种特异性与穴位所在经络及所属脏腑有极大的相关性［11-14］。针刺“肺俞”和“灵台”穴，采用高效液相技术精确分析紫杉醇在体内各脏器和血浆药物浓度，利用药代动力学软件对针刺后紫杉醇在体内吸收、分布、清除等代谢规律进行分析，通过分析针刺对紫杉醇药代动力学的影响，发现紫杉醇在肺脏的分布靶向增强。

参考文献：

［1］REICHMANN B S，SEIDMAN A D，CROWN JPA，et al.Paclitaxe landrecombinant human granu locyte colony-st imulating factor as initial chemotherapy form etastatic breast cancer［J］.CL in Onco，1993，11（10）：943.

［2］SHARMA A，MAYHEW E，BOLCSA K L，et al.Activity of paclitaxel liposome form ulations again st hum an ovarian tumerxenografis［J］.Int JCancer，1997，71（1）：103.

［3］李文军.紫杉醇不良反应文献综述［J］.药物流行病学杂志，2002，11（4）：187.

［4］KONKIMALLA V B，EFFERTH T.Evidence-based Chinese medicine for cancer therapy［J］.Ethnopharmacol.2008，116，207-210.

［5］王振国，陈以国.针药并用治疗不稳定性心绞痛临床观察［J］.辽宁中医杂志，2006，33（1），44-45.

［6］成泽东，陈以国，张利泰.针刺对大鼠体内中药有效成分趋向性影响的实验研究［J］.中国针灸，2002，22（1）：51-53.

［7］陈以国，成泽东，陈明明.针刺对紫杉醇在Lewis肺癌小鼠体内分布趋向性影响的实验研究［J］.中华中医药学刊，2009，27（8）：1584-1587.

［8］成泽东，陈以国.针刺联合紫杉醇对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡相关因子p53、bcl-2蛋白表达的影响［J］.中国中医药信息杂志，2007，14（5），23-24，77.

［9］成泽东，陈以国.针刺联合紫杉醇对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响［J］.针刺研究，2007，32（6）：135-157.

［10］SRINIVASE，MURTHY JN，RAO A R，et al.Recent advances inmolecularmodeling and medicinal chemistry aspects of phospho-glycoprotein［J］.Curr Drug Metab，2006（7）：205-217.

［11］PADOWSKIJM，POLLACK GM，Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Implications of P-Glycoprotein Modulation［J］.Methods Mol Biol，2010，596：359-384.

［12］GUSTAFSON D L，LONG M E，BRADSHAW E L，et al.P450 induction alters paclitaxel pharmacokinetics and tissue distribution withmultiple dosing［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2005 （56）：248-254.

［13］陈以国，成泽东，矫承媛.以脏补脏与中药归经［J］.中医杂志，2004，45（12）：943-944.

［14］成泽东，陈以国.论以脏补脏疗法与中药归经［J］.辽宁中医杂志，2004，31（9）：733-734.

Effect of acupuncture combined paclitaxel on Lewis lung cancer metabolism in m ice

ZHAO Hongliang，CHENG Zedong，LIChunri，ZHANG Xiaoqing，ZHANG Zhixing，CHEN Yiguo*
（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China）

Objective To observe the influence of acupuncture on drug metabolism and drug distribution in vivo，and to study the effects of acupuncture at specific acupoints on drug content in targetorgans.Methods 72 female A/Jmicewere randomly divided into groups and themodelwas established.The squamous cell carcinoma of the lung inmice inducedmode method was used and themice were divided into nine groups randomly，with respective treatment of acupuncture，drugs and

［1］赵洁，雷金艳.酒精性肝病的研究进展［J］.北京中医药，2009，28（11）：907-908.

［2］陈霞，李晟，陈晓阳，等.中草药保健品防治酒精性肝病概况［J］.湖南中医杂志，2013，29（7）：141-142.

［3］袁招红，李宁，王晓云.酒精所致精神障碍肝功能及脂肪肝结果分析［J］.实验与检验医学，2012，30（6）：632-633.

［4］中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范［S］.北京：中华人民共和国卫生部，2003：135-136.

［5］代伟长.酶解泥鳅蛋白对酒精致肝损伤的保护作用［J］.长春中医药大学学报，2010，26（4）：490-491.

［6］张雅博，阮研硕，赵晓红，等.乙醇性胃黏膜损伤及其保护作用的研究进展［J］.食品安全质量检测学报，2013，4（4）：1239-1245.

［7］范远景，张玲，张东吟，等.三羟异黄酮保护急性酒精性肝损伤机制研究［J］.营养学报，2013，35（3）：273-277，282.

［8］赵雪珂，程明亮，张权，等.饮酒对大鼠肝脏乙醇脱氢酶1和乙醛脱氢酶2表达的影响［J］.中华内科杂志，2013，52 （10）：855-857.

［9］杨丽丽，邓志钦，黄维渊，等.灵芝孢子粉对抗亚急性酒精性肝损伤的实验研究［J］.时珍国医国药，2013，24（3）：513.

［10］常彬霞，王华，邹正升，等.酒精性肝病的机理和新的治疗靶点［J］.临床肝胆病杂志，2014，30（2）：113-117.

［11］秦久福，李崎，顾国贤.谷胱甘肽在啤酒抗老化中的作用［J］.食品工业科技，2010，31（6）：361-364.（收稿日期：2014－06－26）acupuncture combined with drugs，the drug concentration was injected in differentgroups ofmice at different time；after processing，relevant organs were extracted，and concentrations of paclitaxel of the tissues and organs（lungs，heart，spleen）was determined by high performance liquid chromatograph.Conclusion Acupuncture atspecific acupoints can increase the content of drug target organs and improve curative effect.

acupuncture；paclitaxel；taxis；lung cancer；mice

book=234,ebook=20

R285.5

A

2095－6258（2015）02－0234－04

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.02.006

2014－10－10）

辽宁省科委课题（2001）；国家中医药管理局基金项目（2004）；国家自然科学基金项目（2005）。

赵宏亮（1984－），男，硕士，中医师，主要从事针灸学研究。