宫颈上皮内瘤变及鳞癌组织中组蛋白去乙酰化酶1的表达及与HPV16/18感染的关系

（1.辽宁医学院病理学教研室，辽宁 锦州 121000；2.锦州市妇婴医院病理科 辽宁 锦州 121001；3.辽宁医学院附属第三医院肿瘤科，辽宁 锦州 121000）

宫颈上皮内瘤变及鳞癌组织中组蛋白去乙酰化酶1的表达及与HPV16/18感染的关系

肖莉1，万义增1，王宝2，李黎3

（1.辽宁医学院病理学教研室，辽宁 锦州 121000；2.锦州市妇婴医院病理科 辽宁 锦州 121001；3.辽宁医学院附属第三医院肿瘤科，辽宁 锦州 121000）

目的探讨宫颈上皮内瘤变（CIN）、宫颈鳞癌组织中组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）的异常表达以及CIN、宫颈鳞癌发病与HPV16/18感染的相关性。方法应用原位杂交（ISH）技术及免疫组织化学（SP）方法检测慢性宫颈炎组织（慢性宫颈炎组）、CIN组织（CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组）和宫颈鳞癌组织（宫颈癌组）中HPV16/18感染以及HDAC1的表达。结果慢性宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和宫颈癌组中HPV16/18的感染率分别为8.33%、34.78%、48.00%、65.21%、78.00%，组间差异有统计学意义（P＜0.05）；HDAC1阳性表达率分别为0、13.04%、32.00%、47.82%和76.00%，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。HPV16/18感染组的HDAC1阳性表达率高于HPV16/18未感染组（P＜0.05）。HDAC1的阳性表达与宫颈癌的临床分期无关（P＞0.05），而与组织分化、间质浸润深度及盆腔淋巴结转移相关（P均＜0.05）。结论在宫颈癌的发生发展中，HPV16/ 18感染可能是通过提高组蛋白去乙酰化酶1的水平抑制转录而发挥作用。

组蛋白去乙酰化酶1；HPV；宫颈上皮内瘤变；宫颈癌；原位杂交

宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌的常见恶性肿瘤，严重威胁女性的生命健康及生活质量。高危型HPV感染与罹患宫颈癌关系紧密［1］。临床数据［2］表明，仅少数HPV持续感染者经漫长演变过程发展为宫颈浸润癌，大部分CIN可持续存在，甚至自然消退。现有研究发现，组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）是表观遗传调控的关键酶，具有抑制基因转录的功能，同时可调节基因表达和介导核小体结构改变，并参与细胞周期进程和分化。组织中HDAC1表达水平的增高使得基因的转录受到抑制，促使肿瘤的发生［3］。HDAC1与妇科相关肿瘤的发生关系密切，Jin等［4］研究显示卵巢癌组织中HDAC1过表达，其在卵巢癌的发生和发展过程中扮演重要角色；任媛媛等［5］应用组织芯片和免疫组织化学SP法检测发现，乳腺癌组织中HDAC1蛋白过表达与肿瘤发生发展密切相关。本研究应用免疫组织化学方法及原位杂交技术检测石蜡包埋的慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）、宫颈癌标本中HPV16/18感染和HDAC1的表达，探讨CIN、宫颈鳞癌发病与HPV16/18感染的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集辽宁医学院附属第三医院病理科2012年1月至2014年6月住院患者经手术切除的宫颈组织标本蜡块。患者年龄28～78岁，平均年龄46.5岁。慢性宫颈炎组织24例、CINⅠ23例、CINⅡ25例、CINⅢ23例、宫颈鳞癌50例。其中宫颈鳞癌50例标本均系宫颈癌根治术后，同时选取因子宫黏膜下肌瘤等良性病变而行子宫全切的无肉眼可见病变的宫颈标本24例作为对照，所选患者术前均未经放疗和（或）化疗，所有HE切片均按照WHO标准经两位病理专家复核，意见一致。按照国际妇产科联盟（FIGO，2009年）的临床分期标准进行分类。

1.2 药品和试剂

浓缩型兔抗人HDAC1多克隆抗体（即用型），SP染色试剂盒及浓缩型DAB显色试剂盒、柠檬酸抗原修复液（0.01 mol/L，pH6.0）及磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH7.2～7.4），胃酶消化液（即用型）、特异性地高辛标记的HPV16/18DNA探针、阳性对照寡核苷酸探针、杂交后洗液、辣根酶标记抗地高辛抗体。以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。实验步骤参照说明书进行。

1.3 方法

1.3.1 原位杂交方法（in situ hybridization，ISH）：阳性对照为试剂盒中对照模板DNA，以正常宫颈组织为阴性对照。

1.3.2 免疫组织化学（SP法）：145例宫颈组织均应用HDAC1多抗免疫组织化学染色方法，按照说明书进行操作。PBS代替一抗作为阴性对照组，HDAC1阳性切片作为阳性对照组。

1.4 结果判定标准

1.4.1 原位杂交检测结果判定标准：细胞核内可见HPV阳性病毒颗粒染成棕黄色，多位于宫颈上皮的中表层细胞。

1.4.2 免疫组化结果判定标准：HDAC1阳性结果判定以棕黄色颗粒出现在细胞核内者为阳性细胞。参考文献［6］，光镜下每张切片均观察5个高倍视野，并计数200个细胞中的阳性细胞数值，取平均值，得出阳性细胞的百分率。0～4%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；以阳性细胞呈现的染色强度计分评价着色强度，浅棕色为1分，棕色为2分，深棕色为3分.将二者相加计算总分，＜2分为阴性（-），≥2分为阳性（+）。

1.5 统计学分析

采用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，相关分析采用Pearson相关系数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HDAC1在不同宫颈病变组织中的表达

慢性宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和宫颈癌组中HDAC1阳性表达率明显不同，差异有统计学意义（χ2=50.561，P=0.000）。趋势检验亦发现，HDAC1随宫颈病变程度增加而呈现表达增强（χ2= 49.432，P=0.000），见表1、图1。

表1 不同宫颈病变组织中HDAC1的表达Tab.1 HDAC1 expression in different cervical lesion tissues

2.2 不同宫颈病变组织中HPV16/18感染情况

HPV16/18感染在慢性宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组及宫颈癌组中差异显著（χ2=36.248，P=0.000）。应用趋势检验发现，HPV16/18感染的阳性率随着宫颈病变程度加重而增加（χ2=35.458， P=0.000）。见表2、图2。

图1 不同宫颈病变组织中HDAC1表达 ×200Fig.1 HDAC1 expression in different cervical lesion tissues×200

表2 HPV16/18在不同宫颈病变组织中的检测结果Tab.2 Test results of HPV16/18 in different cervical lesion tissues

图2 不同宫颈病变组织中HPV16/18感染 ×200Fig.2 HPV16/18 infection in different cervical lesion tissues×200

2.3 HPV16/18感染与HDAC1在宫颈鳞癌组织中的表达关系

50例宫颈鳞癌组织中，HPV16/18阳性组HDAC1阳性表达明显高于HPV16/18阴性组（χ2= 4.396 8，P=0.042），见表3、图2。

2.4 HDAC1阳性表达与宫颈癌临床病理特征的相关性

结果显示：HDAC1的阳性表达与宫颈癌的临床分期无关（P＞0.05），而与组织分化、间质浸润深度及盆腔淋巴结转移相关（P＜0.05），见表4。

3 讨论

目前，已公认高危型HPV感染是宫颈癌及癌前病变的关键致病因素。机体细胞的免疫作用在HPV持续感染时受到影响，抑制其抗肿瘤作用，使宫颈局部微环境免疫平衡状态失调，起到促进肿瘤发展的作用［7］。单纯形态学检查往往无法确定CIN的预后及转归，随着分子生物学的进展，寻找有助于宫颈癌早期诊断的分子生物学指标正成为研究热点。大量研究［8］证实单纯HPV感染尚不足以引起宫颈癌，还需要其他分子事件的共同参与。

表3 宫颈鳞癌中HPV16/18感染与HDAC1表达的关系（n）Tab.3 The relationship between HPV16/18 infection and expression of HDAC1 in cervical squamous cell carcinoma（n）

表4 HDAC1阳性表达率与宫颈癌临床病理特征的相关性Tab.4 The correlation between the positive expression rates of HDAC1 and clinical pathological features of cervical cancer

组蛋白是真核生物细胞核核染色体的重要成分之一，其乙酰化及去乙酰化是基因表达过程中重要的调控方式，在转录过程中起关键的修饰作用。HDAC通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控参与肿瘤的发生、发展过程。HDAC1为第一类组蛋白去乙酰化酶，可抑制基因转录，亦可于细胞周期的进展及分化过程中发挥重要作用。Huang等［9］研究显示在子宫颈癌及CIN组织中HDAC呈高表达状态；王水英等［10］应用免疫组织化学和免疫印迹方法研究发现，HDAC1在子宫内膜异位症在位及异位内膜组织中呈高表达状态，可能在子宫内膜异位症发生、发展中起着关键作用；邢军等［11］应用PCR技术、免疫组化方法研究得出HDAC1通过抑制基因的转录而在宫颈癌的病程进展中起作用的结论。目前已知的HPV以高危型HPV16/18为导致人类上皮恶性肿瘤发生的主要病毒，在亚洲地区包括我国（尤其广西地区）HPV58型具有感染特异性，是40岁以上妇女发生宫颈癌的主要高危因素［12，13］。HPV16/18致癌主要环节为HPV16E6、E7整合至DNA上促使宿主细胞大量异常增生并恶性转化，同时促使某些信号通路蛋白表达改变，从而使宿主细胞失衡引起宫颈鳞癌发生。HDAC1可移除组蛋白lys残基上的乙酰基，恢复组蛋白正电性，使组蛋白与DNA之间的吸引力加强，导致启动子不易接近DNA上的转录调控元件，继而抑制DNA的转录过程。本研究应用ISH及免疫组化技术验证上述观点，HDAC1阳性表达率在慢性宫颈炎组、CIN组及宫颈癌组中逐渐增强，提示HDAC1在子宫颈癌的发生、发展过程中逐渐累积并参与子宫颈癌的病变过程。同时，HPV16/ 18感染组其HDAC1阳性表达率明显高于HPV16/ 18未感染组，说明了HPV16/18和HDAC1可能共同作用于宫颈癌的发生及发展过程。

目前，国内外采用国际妇产科联盟（FIGO，2009年）的临床分期标准进行病理分期，同时结合TNM分期系统，根据宫颈癌的组织分化、临床分期及间质浸润深度、盆腔淋巴结转移等情况对宫颈癌患者提出个体化治疗方案，以期获得最佳预后。孙大伟等［14］研究发现，宫颈癌标本中在组织分化程度、间质浸润深度、盆腔淋巴结转移与ID-1阳性表达相关，而与临床分期不相关。王燕等［15］研究结果提示：c-myc蛋白及hMLH1蛋白表达与肿瘤分化程度及是否淋巴结转移相关。王宝等［6］研究发现宫颈癌中FHIT蛋白低表达水平并不随临床分期进展及组织分化程度不同而差异显著。本研究结果显示，HDAC1在宫颈癌组织中的表达与组织分化程度、间质浸润深度、盆腔淋巴结转移相关，而与临床分期不相关。提示HDAC1表达状态在一定程度上反映了肿瘤分化程度，可明显增加肿瘤细胞的增殖能力，并使肿瘤细胞的侵袭及移行作用明显增加。HDAC1表达与否及表达强弱可作为临床分期、子宫颈癌恶性程度高低的一项组织学指标，也可作为宫颈癌早期筛查诊断和监测预后的指标，可为临床早期复发提供新线索。

综上所述，HPV16/18感染促使组蛋白去乙酰化酶的异常表达，在CIN及宫颈癌的发生、发展过程中起重要作用。应用HDAC1及HPV16/18两个指标联合检测，对宫颈癌发生发展的监测及防治可能具有重要的参考价值及临床意义。

［1］Yan J，Reichenbach DK，Corbitt N，et al.Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of a novei HPV-16 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion antigen［J］.Vaccine，2009，27（7）：431-440.

［2］崔丽阳，岳天孚.高危型HPV持续感染的影响因素探讨［J］.天津医科大学学报，2014，20（3）：209-213.

［3］付小玲，薛秀珍.HDAC1、DNMT1、RECK在宫颈癌中的研究进展［J］.河南科技大学学报（医学版），2012，30（3）：238-240.

［4］Jin KL，Pak JH，Park JY，et al.Expression profile of histone deacetylases 1，2 and 3 in ovarian cancer tissues［J］.Gynecol Oncol，2008，19（3）：185-190.

［5］任媛媛，王雅杰.HDAC1和DNMT1蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义［J］.临床肿瘤学杂志，2010，15（2）：101-105.

［6］王宝，高志安，李春宏，等.FHIT基因在宫颈CIN及鳞癌中的表达及其与HPV16/18感染的关系［J］.辽宁医学院学报，2007，16（6）：15-18.

［7］宋文君，王英红.HPV感染与机体特异性免疫状态的相关性研究进展［J］.医学综述，2013，19（7）：1188-1190.

［8］赵俊玲，王若峥.HPV感染及HLA多态性与宫颈癌相关性研究进展［J］.医学综述，2014，20（18）：3306-3309.

［9］Huang BH，Laban M，Leung CW，et al.Inhibition of histone deaceiylase2 increases apoptosis and p21Cip1/WAf1 expression，independent of histone deacetylase 1［J］.Cell Death Differ，2005，12（4）：395-404.

［10］王水英，罗琼，胡燕军，等.组蛋白去乙酰化酶1在子宫内膜异位症中的表达及意义［J］.解剖学报，2009，40（3）：500-502.

［11］邢军，岳天孚，李秀伟，等.宫颈病变中HDAC1的表达以及与HPV16感染的关系［J］.中国妇幼保健杂志，2011，26（8）：1217-1219.

［12］何俊炜，杜鹃.广西南宁地区女性人乳头瘤病毒感染情况分析［J］.中国妇幼保健杂志，2013，28（1）：38-40.

［13］朱佳妮，丁爱萍，张淑兰.HPV58与宫颈癌研究进展［J］.国际妇产科学杂志，2014，41（2）：137-141.

［14］孙大伟，冷双，李荷莲，等.分化抑制因子-1在宫颈癌组织中表达及其与微血管密度的关系［J］.中国实用妇科与产科杂志，2012，1（28）：38-40.

［15］王燕，古丽娜尔库尔班，阿仙姑哈斯木，等.子宫颈癌中c-myc和hMLH1表达与HPV16感染的关系［J］.临床与实验病理学杂志，2012，28（2）：199-201.

（编辑武玉欣）

Association between Expression ofHDAC1 Protein andHPV16/18 Infection in Cervical IntraepithelialNeoplasia and Cervical Squamous Cell Carcinoma

XIAOLi1，WAN Yi-zeng1，WANG Bao2，LILi3
（1. Department of Pathology，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2. Department of Pathology，Women and Children Hospital of Jinzhou City，Jinzhou121001，China；3.Department of Oncology，The Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou121000，China）

ObjectiveTo explore the anomalous expression of HDAC1 in cervical intraepithelial neoplasia（CIN）and cervical carcinoma and its relationship with the infection ofHPV16/18.MethodsThe expressions ofHDAC1 protein and HDAC1 infection were detected by in situ hybridization（ISH）and immunohistochemistry staining（SP）in tissues from patient with chronic cervicitis（the chronic cervicitis group），CIN（the CINⅠgroup，the CINⅡgroup and the CINⅢgroup）and cervical squamous carcinoma（the cervical carcinoma group）.ResultsThe infection rate of HPV16/18 was 8.33%，34.78%，48.00%，65.21%，78.00%in patients with chronic cervicitis，CINⅠ，CINⅡ，CINⅢ and cervical carcinoma respectively.There was significant difference between groups（P＜0.05）.The positive expression rate of HDAC1 was 0，13.04%，32.00%，47.82% and 76.00%in chronic cervicitis，CINⅠ，CINⅡ，CINⅢ and cervical carcinoma，respectively.The differences were statistically significant（P＜0.05）.The positive expression of HDAC1 in the HPV16/18 infected patients was significantly higher than those uninfected with HPV16/18（P＜0.05）.The HDAC1 positive expression had no relationship with clinicalstages of cervical carcinoma，however，itwas related to the tissue differentiation，stromal invasion and pelvic lymph node metastasis（all P＜0.05）.ConclusionThe infection of HPV16/18 may play an important role in the carcinongenesis of SCC through increasing the expression ofHDAC1.

histone deacetylase 1；HPV；cervical intraepithelial neoplasia；cervical carcinoma；in situ hybridization

R711.74

A

0258-4646（2015）05-0464-05

肖莉（1971-），女，副主任医师，硕士研究生.

万义增，E-mail：m18004961660@163.com

2014-12-29

网络出版时间：