骨质疏松症SD大鼠废用残根对周围牙槽骨组织影响的研究

（中国医科大学附属口腔医院修复一科，辽宁省口腔医学研究所，辽宁省口腔疾病转化医学研究中心，沈阳 110002）

骨质疏松症SD大鼠废用残根对周围牙槽骨组织影响的研究

李晶，艾红军，洪岩松

（中国医科大学附属口腔医院修复一科，辽宁省口腔医学研究所，辽宁省口腔疾病转化医学研究中心，沈阳 110002）

目的研究患有骨质疏松症的老年患者口腔废用的残根对牙周组织和牙槽骨的影响。方法SD大鼠（12周龄）雌雄各30只，随机分成2组：对照组（假手术，雌雄各10只）、实验组（去势手术，雌雄各20只）。12周后双能X线检测所有大鼠右侧股骨的骨密度值以确定实验组大鼠的骨质疏松症。将所有大鼠右侧磨牙牙冠用止血钳平齐牙龈夹断，牙根保留，术后2周和4周分别处死对照组10只、实验组20只大鼠。取大鼠右侧磨牙区牙槽骨组织，采用HE染色法观察残根的牙周膜和牙槽骨形态；免疫组化染色和real time RT-PCR方法检测TNF-α和一氧化氮合酶2（NOS2）的表达。结果实验组的牙周组织较对照组有明显的破坏，牙周膜的结构变得稀疏，骨质破坏现象随着时间延长而加重；TNF-α在对照组牙周膜中仅表现为少量的棕黄色颗粒，而在实验组中的染色则明显加深；实验组TNF-αmRNA表达显著高于对照组（P＜0.05），而NOS2的趋势则刚好相反。两种细胞因子在2周、4周时比较没有统计学差异（P＞0.05）。结论骨质疏松症大鼠保留的废用残根能加速周围牙槽骨组织吸收，造成不良影响。因此，患有骨质疏松症老年患者口腔中的废用残根应尽快拔除。

骨质疏松症；咬合力丧失；TNF-α；一氧化氮合酶2；大鼠

骨质疏松症是以骨量减少、骨组织纤维结构退化、松质骨骨小梁变细、断裂、数量减少、皮质骨多孔、变薄为特征，骨的脆性增高及骨折危险性增加的一种全身性疾病［1，2］，目前已被列为世界上发病率、死亡率及保健费用消耗较大的疾病之一。颌骨是全身骨的一部分，颌骨骨组织的代谢、骨量的变化受全身骨代谢变化的影响。国内外研究者［3，4］注意到骨质疏松加速失牙后剩余牙槽骨的吸收，使剩余牙槽骨的高度降低，宽度变窄，从而影响义齿修复，造成种植困难或失败，使咀嚼功能下降，严重影响老年人失牙后的生活质量。

已有研究表明［5，6］全身骨量减少与颌骨骨密度下降呈正相关。在口腔中，颌骨支持固位牙齿，行使咀嚼功能。牙拔除后，颌骨因创伤失去正常合力的刺激等因素使颌骨的高度下降、宽度变窄、剩余牙槽骨骨量降低，骨密度下降，从而结构受损。有人用动物模型比较了骨质疏松症的动物和正常等动物拔牙术后失牙区牙槽骨的硬组织切片，结果发现，骨质疏松组的成骨细胞数量较正常组数量少，而破骨细胞的数量则很高［3］。很多学者认为老年人残根应该尽量保留，这样做不仅能够预防牙槽骨吸收，还有利于对脑功能良性的刺激［7］。对于没有修复价值的残根，多数老年人也不愿意主动拔除。这些残根多数低于牙槽骨水平，被炎症、增生的牙龈组织包绕，同时暴露的根面部分存在大量软化的腐质，使食物积存，产生口臭。为了研究患有骨质疏松症的老年患者口腔中未拔除的残根对牙槽骨组织的影响，本研究采用去势的SD大鼠建立骨质疏松模型，夹断右侧下颌的磨牙牙冠建立咬合丧失的动物模型，观察残根周围的牙周组织形态，同时对TNF-α和一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase-2，NOS2，也称为Ⅱ型NOS，NOS-Ⅱ和iNOS）两种细胞因子免疫组化染色和qRT-PCR检测，旨在深入探讨患有骨质疏松症的老年患者的牙齿残根拔除问题。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及骨质疏松模型建立：3月龄SD大鼠，购自中国医科大学，许可证号SYXK（辽）2003-0013，体质量200 g，60只，分别于乙醚浅麻醉下施行无菌手术：（1）去势组（骨质疏松组）：雌性大鼠（20只）手术摘除双侧卵巢，缝合切口；雄性大鼠（20只）手术切除双侧睾丸及附睾，缝合切口；（2）伪去势组（对照组）：雌雄性大鼠各10只，雌鼠切除卵巢周围少许脂肪组织，雄鼠切除睾丸周围少许脂肪组织。术后第12周，数字化快速双能X线扫描骨密度仪XR-600（美国Norland公司）检测实验组大鼠右侧股骨的骨密度（bone mineral density，BMD），确定骨质疏松模型已建立。

1.1.2 建立咬合丧失动物模型：60只大鼠乙醚浅麻醉下撑开口腔，用止血钳夹碎全部右侧磨牙牙冠，保留牙根，断面平齐龈端。术后正常喂养。

1.2 免疫组化法检测TNF-α和NOS2

术后2周时安乐处死去势组大鼠（雌雄各10只）和伪去势组大鼠（雌雄各5只）；术后4周时安乐处死去势组大鼠（雌雄各10只）和伪去势组大鼠（雌雄各5只）。取材大鼠右侧磨牙区牙槽骨，4%甲醛固定，脱钙，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，组织切片，HE染色。免疫组化法对TNF-α和NOS22种细胞因子染色，SP试剂盒（美国ZYMED公司）严格按照说明书程序操作。免疫组化染色步骤：失蜡；室温孵育；冲洗；山羊血清封闭，滴加一抗（英国Abcam公司），孵育4℃过夜；冲洗3次；滴加二抗（美国Proteintech公司），37℃孵育10～30 min；冲洗3次；第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 min；冲洗3次；显色剂DAB显色；封片。

1.3 Real time RT-PCR检测

采用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取总RNA，通过酶标仪（澳大利亚Tecan公司）测定吸光度比值OD260/OD280检测RNA浓度和纯度。定量逆转录聚合酶连反应（RT-qPCR）使用GoTaq®1-Step RT-qPCR System（美国Promega公司），终体积为20 μL含10 μL GoTaq®qPCR Master Mix、100 ng正、反向引物（表1，日本TaKaRa公司）各2 μL、GoScriptTM0.4 μL、100 ng RNA 4 μL，42℃反转录15 min，95℃、10 min，然后进行变性步骤：95℃、10 s，40个循环、退火温度30 s，72℃、30 s，40个循环。解离条件：95°C、15 s，60°C、15 s，95°C、15 s，60°C、15 s。βactin作为内参。实验结果采用ΔΔCT法表述。以上所有实验重复3次。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 骨质疏松症动物模型的建立

双能X线结果表明，骨质疏松组大鼠的骨密度值比对照组显著降低（P＜0.05），见表2。

2.2 HE染色结果

对照组在术后2周和4周时，牙根膜的结构致密，成纤维细胞排列有序，见图1A、1C。骨质疏松组在术后2周时，牙周膜已经增宽，结构松散，成纤维细胞排列紊乱，见图1B。这些变化在术后4周时更为明显，相邻的牙周膜牙槽骨开始被吸收，甚至不平整，见图1D。

表1 实时定量PCR所用引物序列Tab.1 Primer sequences used in gene expression analysis with qRT-PCR

表2 2组大鼠的骨密度值比较Tab.2 Comparison of bone mineral density between the control and osteoporosis rats

图1 牙周膜组织的HE切片Fig.1 The slices of periodontal ligament stained by HE

2.3 TNF-α和NOS2的免疫组化染色结果

结果显示，TNF-α颗粒被染成褐色。术后2周时对照组牙周膜边界清晰，成纤维细胞的细胞质中可见一些褐色颗粒；而骨质疏松组中可见大量的褐色颗粒，牙周膜已经增宽，边界模糊，见图2A、2B。术后4周的染色结果显示，与术后2周比较，对照组TNF-α的量几乎没有改变。但骨质疏松组可以看到相邻的牙槽骨已经吸收，甚至不平整，见图2C、2D。NOS2颗粒也被染成褐色，它的表达规律与TNF-α刚好相反。术后2周时，骨质疏松组仅有少量的棕色颗粒，而对照组中则大量表达，见图3A、3B；术后4周时，与2周结果比较，对照组NOS2的量几乎没有改变，而骨质疏松组牙槽骨已经被破坏，见图3C、3D。

图2 牙周膜中TNF-α的免疫组化染色Fig.2 The slices of TNF-α in periodontal ligament by immunohistochemical staining

图3 牙周膜中NOS2的免疫组化染色Fig.3 The slices of NOS2in periodontal ligament by immunohistochemical staining

表3 2组大鼠TNF-α和NOS2的real timeRT-PCR检测结果比较（%）Tab.3 Quantitative analysis of qRT-PCR for TNF-α and NOS2in periodontal ligament（%）

2.4 TNF-α和NOS2的real time RT-PCR检测结果

结果可见，术后2周、4周时骨质疏松症组中的TNF-αmRNA表达显著高于对照组（P＜0.05），而NOS2mRNA表达显著低于对照组（P＜0.05）。

3 讨论

骨质疏松症是发病率较高的一种老年疾病。为了便于研究，成熟大鼠是最常用的动物模型。大鼠生命周期短，快速的骨代谢率、性激素水平的改变与人类似，易于饲养且成本低。其影响因素单一，可重复性强，并且极其贴近老年患者的骨质疏松症状［8］，去势（切除卵巢或睾丸）是目前用于诱导骨质疏松症的最常用方法，3～6个月龄大鼠被广泛使用。一般情况下，雌性大鼠在去势手术3～4个月、雄性大鼠在去势手术3个月时骨质疏松症就会形成［9］。进行确认时多采用检测骨密度的数值［10］。研究表明，大鼠身体不同部位的骨吸收速度也不同：在原发性骨质疏松症中，骨质流失的速度是腰椎最快，其他依次为胫骨＞股骨＞腰椎体＞胫骨段＞股骨［11］。因此，我们对去势术后3个月的SD大鼠进行右侧股骨的骨密度值检测，以确定骨质疏松症动物模型的建立。

骨质疏松症的进展与许多细胞因子密切相关，它们的表达变化表明骨破坏的进程。我们选择了TNF-α和NOS2两种细胞因子。TNF-α能激活破骨细胞，同时抑制成骨细胞功能［12，13］。TNF-α在骨的病理过程中具有核心作用：除了作为NF-κB配体的受体活化剂以外，它是必需的激活破骨细胞因子，同时也抑制成骨细胞的骨形成过程。此外，TNF-α在牙周病的发生和发展中起着重要的作用［14］。牙周炎患者的牙龈组织和龈沟液中存在着大量的TNF-α，它的表达与牙周炎的进展程度呈正相关［15］。在牙周病活跃的部位，TNF-α表达比正常值要高得多。还有研究表明［15，16］牙周炎患者血液中TNF-α表达显著高于正常值。

NOS2是广泛存在于组织和细胞里的一种异构酶。NOS和一氧化氮（nitric oxide，NO）与骨代谢密切相关联［18］，并且NO在成骨细胞和破骨细胞的信号传导进程中起重要作用［19］。在体外，NO抑制破骨细胞的吸收；在体内，对骨有重塑功能。因此，药物和条件的改变可以引起局部NO浓度的变化，从而引起骨的重塑。NO也降低RANKL的受体水平，从而抑制破骨细胞，减少骨吸收［19］。正常组织中存有将一定量的NOS2以保持骨形成和吸收之间的平衡。通常情况下，高浓度的NOS2的抑制破骨细胞功能，促进成骨细胞活性，促进骨形成；而NOS2的下降会导致相反的结果。

本研究建立了咬合力丧失的大鼠模型来模拟骨质疏松症的患者，进而评估残根对其周围牙周组织的不利影响。骨质疏松组大鼠HE组织切片可以观察到残根周围的牙周韧带结构紊乱，牙槽骨出现吸收；对残根周围组织中含有的TNF-α和NOS2两种损害性细胞因子进行免疫组化染色和real time RTPCR检测，结果都一致，均提示牙周组织正在损害进行中。并且这些变化随时间的延长而恶化。因此，我们认为骨质疏松症大鼠口腔中的残根对牙周组织有明显的破坏作用。这与Ejiri等［3］和张贤华等［7］的保存残根的观点刚好相反。

综上所述，本研究通过建立动物模型方法模拟骨质疏松症患者口腔中的疾病情况，结果说明对骨质疏松患者而言，残根的存在加速了骨破坏进程。因此这些残根不应该保留，应尽早拔除，纠正骨质疏松症患者不拔牙的误区。但是本研究对残根加速骨吸收的机制尚不明了，这有待于进一步研究。

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（编辑武玉欣）

Effect of Crownless Roots on Surrounding Alveolar Bone Tissues in SD Rats withOsteoporosis

LIJing，AIHong-jun，HONG Yan-song
（Department of Prosthodontics，School of Stomatology，China Medical University，Institute of Oral Medicine of Liaoning Province，Liaoning Province Oral Diseases Translational Medicine Research Center，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo study the adverse effects on periodontal tissues caused by crownless roots in elderly people with osteoporosis.MethodsTotally 60 12-week SD rats（30 male and 30 female）were randomly divided into the control group（10 male and 10 female sham-operated rats）and the osteoporosis group（20 male and 20 female castrated rats）.After12 weeks，the bone mineraldensity of right femora was measured by dualenergy X-ray for all rats to confirm osteoporosis.The right molarcrown was pinched off with haemostatic forceps and the molar root was retained.The 10 control rats and the 20 experimental rats were sacrificed respectively at postoperative 2 and 4 weeks.The periodontal tissues of right molar were sampled and the morphology of the parodontium and the alveolar bone was observed by haematoxylin and eosin（HE）staining and the expression of tumour necrosis factor-alpha（TNF-α）and inducible nitric oxide synthase-2（NOS2）was detected by immunohistochemical staining and real time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR）.ResultsThe HE slices indicated that the periodontal tissues in the osteoporosis group were significantly impaired compared to the control group as the structure of parodontium loosened.Bone impairment aggravated over time.TNF-α staining showed as a few claybank spots on the parodontium in the controlgroup，while the staining colourwasdarkened in the osteoporosisgroup.The expression of TNF-αmRNA was significantly higher in the osteoporosis group than in the control group（P＜0.05）.The result of NOS2was contrary to that of TNF-α. The differences in TNF-α and NOS2were not statistically significant at 2 and 4 weeks（P＞0.05）.ConclusionThe crownless roots in rats with osteoporosis cause adverse effects of periodontal tissues as the roots accelerate absorption of the surrounding alveolar tissues.It is indicated that crownlessroots in elderly people with osteoporosis should be removed assoon as possible.

osteoporosis；bite force loss；TNF-α；nitric oxide synthase-2；rats

R783.3

A

0258-4646（2015）05-0400-05

辽宁省教育厅一般项目（L2013309）；辽宁省自然科学基金（201102280）

李晶（1980-），女，主治医师，博士.

E-mail：monkeys0109@sina.com

2015-01-05

网络出版时间：