微波辅助萃取-气相色谱法同时测定皮革及其制品中21种有害有机溶剂残留量

王成云，施钦元，邬晓慧，林镱琳，沈雅蕾，褚乃清

(深圳出入境检验检疫局工业品检测技术中心，广东深圳518067)

1 引言

酰胺类溶剂、乙二醇醚类溶剂和N-甲基吡咯烷酮 (NMP)均具有优异的溶解性能，在皮革工业中作为溶剂广泛使用[1-3]，但是，这些有机溶剂可能会残留在最终产品中，给消费者带来潜在的危险。随着这几类有机溶剂的大规模使用，其在使用过程中造成的职业性暴露及其对使用者造成的危害也不容忽视。随着科技的进步和生活水平的提高，人们越来越关注涉及人体健康的化学品的使用。为确定这些有机溶剂的毒性，人们进行了大量研究[4-6]，结果发现，NMP、部分酰胺类溶剂和部分乙二醇醚类溶剂均能致癌、致畸变，为此各国纷纷立法加以限制，被限制使用的有害有机溶剂种类不断增加。欧盟先后发布指令97/56/EC、36/2003/EC、1348/2008/EC、2009/6/EC、48/2009/EC、552/2009/EC，限制使用 DEGBE、DEGDME、DEGME、DMA、DMF、EGBE、EGDEE、EGDME、EGEE、EGME、MA、MF、NMP、TEGDME、甲酰胺等15种有机溶剂，欧洲化学品管理局更是将DEGDME、DMA、DMF、EGDEE、EGDME、EGEE、EGME、MA、NMP、TEGDME、甲酰胺等11种有机溶剂列入高关注物质 (SVHC)清单。本文对21种有害有机溶剂进行了研究，表1给出了相关的信息。

国外对这些有害有机溶剂的严厉限制给我国皮革及其制品的出口设置了一道新的技术贸易壁垒，建立1个能同时测定包含上述15种限用有机溶剂在内的多种有害有机溶剂含量的分析方法，具有十分重要的意义。关于上述3类有害有机溶剂含量的测定，已有大量文献报道[7-15]，但这些文献报道的测定对象均未全部涵盖上述15种限用有机溶剂。本文以甲醇为萃取溶剂，采用微波辅助萃取技术提取皮革及其制品中残留的有害有机溶剂，用硅胶固相萃取柱对提取液进行净化，然后进行气相色谱-火焰离子化检测器 (GC-FID)分析，建立了1个能同时测定皮革及其制品中21种有害有机溶剂含量的气相色谱方法，并应用该方法对市售皮革及其制品中有害有机溶剂的残留量进行了测定。

表1 21种有害有机溶剂

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Agilent 7890B-5977A气质联用仪 (美国Agilent公司，配FID检测器);ETHOS 1微波萃取仪 (意大利Milestone公司);Retch SM2000织物研磨仪 (德国Retch公司);Heidolph 4003旋转蒸发仪 (德国 Heidolph公司);0.22 μm滤膜(德国Membrane公司);氮吹仪 (北京康林科技有限责任公司);硅胶固相萃取柱 (美国Waters公司，1g/6mL)。

色谱纯甲醇由美国Merck公司提供;标准品均由德国Dr.Ehrenstorfer公司提供，首先用甲醇配制质量浓度约为2000 μg/mL的标准储备液，再各取适量体积的标准储备液，用甲醇配制混标储备液，混标储备液中各组分的浓度见表1。使用时再用甲醇逐级稀释，配制系列混标工作液。分析纯试剂甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、叔丁基甲醚、正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃、石油醚均由广州化学试剂厂提供。

自制阳性样品:黑色牛皮革，采用浸渍-烘干-焙烘工艺制备，含有 EGDME、EGDEE、DEGDME、EGDBE、DEGDEE、NMP等6种目标分析物。

2.2 样品前处理

将待测样品用织物研磨仪磨成粉末，混匀后取约1.0 g样品，置于微波萃取管中，加入17mL甲醇，在85℃下微波辅助萃取30 min，冷却至室温，过滤，将滤液真空旋转蒸发至约5mL，转移至已用5mL甲醇进行预活化处理的硅胶固相萃取柱中，使其缓慢流出，控制流出速度为2滴/秒，收集流出液。用5mL甲醇分3次淋洗固相萃取柱，继续收集流出液。流出液真空旋转蒸发至近干后，转移到氮吹仪中，用干燥氮气将其缓慢吹干，残留物用1mL甲醇溶解，所得溶液经0.22 μm滤膜过滤后直接进行GC-FID分析，外标法定量。必要时，先进行适当稀释。

2.3 分析条件

DB-Wax 色谱柱 (60m 0.25mm 0.25μm)，升温程序:起始温度60℃，保持5 min，以20℃/min的速度升至220℃，保持10 min。后处理时间3 min，后处理温度245℃。进样量1.0μL，不分流进样，0.75 min后开阀。载气为氮气，流速为1.0mL/min，氢气流量30mL/min，空气流量400mL/min。进样口温度240℃，检测器温度250℃，传输线温度280℃。

3 结果与讨论

3.1 净化条件的优化

皮革及其制品的基质十分复杂，采用微波辅助萃取技术提取其中的目标分析物时，大量伴生杂质也同时被萃取出来，对目标分析物的测定造成十分严重的干扰，需要对提取液先进行净化处理后才能进行仪器分析[16]。固相萃取柱净化技术集富集、分离、净化功能于一体，常用于皮革样品的净化。该技术的核心是填料，不同填料的极性和吸附原理各不相同，对目标分析物的净化效果相差极大。固相萃取柱的容量、洗脱液种类及体积、洗脱速度均对净化效果有一定影响。在净化过程中，杂质吸附在固相萃取柱上，目标分析物则大部分被洗脱下来，但也有部分目标分析物被吸附在固相萃取柱上，造成目标分析物的损失。因此在选择固相萃取柱时，必须同时考虑萃取柱的净化能力和目标分析物的损失。NMP、乙二醇醚类溶剂、酰胺类溶剂均具有较强的极性，为获得较好的净化效果，应选用填料极性较强的固相萃取柱，并用较强极性的洗脱液进行洗脱。以不含目标分析物的猪皮革、牛皮革和羊皮革提取液为空白基质，各加入1mL混标，作为实际样品提取液。同时考察了AccuBond Florisil PR柱(0.5g/3mL)、Agilent Bond Elut Al-N 柱 (0.5g/3mL)、Supelclean ENVI-18 SPE 柱 (0.5g/3mL)、Supelclean LCC18柱 (0.5g/3mL)、Supelclean LC-Ph SPE 柱 (0.5g/3mL)、Varian Bond Elut SCX 柱 (0.5g/3mL)、Waters Sep-Pak Vac柱 (0.5g/3mL)、Agilent Bond Elut C18柱 (1g/6mL)、Agilent Bond Elut Si柱 (1g/6mL)、Anpelclean PA SPE柱 (1g/6mL)、CNWBond LC-C18柱 (1g/6mL)、Supelclean LC-C18SPE柱 (1g/6mL)、Supelclean LC-Florisil SPE柱 (1g/6mL)、Supelclean LC-Si SPE柱 (1g/6mL)、Waters Sep-Pak Vac Silica柱 (1g/6mL)、Varian HF Bond Elut C18柱 (2g/12mL)等16种不同填料、不同容量的固相萃取柱对混标和上述3种实际样品提取液的处理效果，并与未经固相萃取柱处理的混标进行对比，计算各组分的回收率，结果发现，Waters Sep-Pak Vac Silica柱 (1g/6mL)的净化效果最好，对混标的回收率为92.3% ～101.3%，对3种实际样品的回收率为87.1% ～92.5%，均远好于其他15种固相萃取柱。分别考察了固相萃取柱容量 (0.5g/3mL、1g/6mL)、洗脱液 (甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、四氢呋喃)、洗脱速度 (1、2、3、4滴/秒)、洗脱液体积 (5、10、15、20mL)等因素对净化效果的影响，洗脱条件最终优化为:萃取柱为Waters Sep-Pak Vac Silica柱 (1g/6mL)，以5mL甲醇为洗脱溶剂，洗脱速度为2滴/秒。

3.2 萃取条件的优化

微波辅助萃取的效率取决于所用萃取溶剂、萃取时间、萃取温度、萃取压力，较长的萃取时间、较高的萃取压力、较高的萃取温度均有利于提高萃取效率，但最关键的因素是萃取溶剂。通常情况下，萃取温度设定为比溶剂沸点高10～20℃，萃取溶剂体积则一般为萃取管总体积的1/3，因此对于每种萃取溶剂，一旦其萃取温度确定，萃取压力也随之而定。萃取温度和萃取压力的上限受制于萃取管材质，本实验所用萃取管材质为聚四氟乙烯，可承受260℃的高温和50个大气压的高压。通常所用溶剂沸点均不超过150℃，萃取管内压力均不超过20个大气压。因此，为尽可能地提供萃取效率，可将萃取温度设定为比溶剂沸点高20℃。通常情况下，微波萃取时间超过15 min时，萃取效果就可得到保证，萃取时间继续增加时，萃取效率基本无变化。为了保证萃取效果，本文萃取时间选定为30 min。

溶剂的微波吸收特性、溶剂与基质间的相互作用和目标分析物在溶剂中的溶解度均直接影响溶剂的微波萃取效果，采用不同溶剂作为微波萃取溶剂，微波萃取效率相差极大。分别以甲醇、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、乙酸乙酯/二氯甲烷 (1∶1，V/V)、丙酮、丙酮/正己烷 (1∶1，V/V)、叔丁基甲醚、二氯甲烷、四氢呋喃、石油醚等12种常见溶剂为萃取溶剂，对2个阳性样品进行微波萃取 (其中1#样品为黑色羊皮革，含有DMF、DEGEE和DEGBE，2#样品为自制 样 品，含 有 DEGDEE、DEGDME、EGDBE、EGDEE、EGDME、NMP)，测定各组分的萃取量，计算2个样品的总萃取量，以总萃取量判断溶剂的萃取效果，结果见表2。从表2数据可以看出，对于同一样品中的不同组分，最大萃取量对应的溶剂各不相同。对于1#样品，最佳溶剂是丙酮/正己烷 (1∶1)，其次是甲醇，对于2#样品，最佳溶剂是甲醇，其次是乙酸乙酯/二氯甲烷 (1∶1)。对于2个样品，甲醇或是最佳溶剂，或萃取效果接近最佳溶剂。综合考虑，选择甲醇作为萃取溶剂。

表2 不同溶剂的萃取效果 (mg/kg)

3.3 分析条件的优化

不同色谱柱的固定相不同，由于被分离的组分在固定相和流动相中的分配系数不同，在色谱分离过程中，被分离的组分在固定相和流动相之间反复分配，最终实现各组分的分离，不同色谱柱的分离效果相差极大。考察了HPInnowax(30 m(0.25mm(0.25 μm)、DB-5MS(60 m(0.25mm(0.25 μm)、DB-Wax(30 m(0.25mm(0.25 μm)、DB-Wax(60 m(0.25mm(0.25 μm)、DB-5HT(15 m(0.25mm(0.10 μm)、DB-624(30 m(0.25mm(1.4 μm)、DB-5MS(30 m(0.25mm(0.25μm)、DB-35MS(30 m(0.25mm(0.25 μm)等 8 种不同色谱柱对21种有害有机溶剂的分离效果，结果发现能将21种有害有机溶剂完全分离的色谱柱只有DB-Wax(60 m(0.25mm(0.25 μm)。

表3 正交实验

图1 21种混标的GC-FID图峰号同表4

各组分的色谱峰面积取决于进样口温度、检测器温度和载气流速，在只考虑单一因素影响时，进样口温度、检测器温度和载气流速的最佳值分别为230℃、250℃和1.1mL，在此条件下，其总峰面积分别达到最大值。综合考虑这3个因素对峰面积的影响，设计了表3所示的正交实验条件，测定每个条件下各组分的峰面积，并计算总峰面积，以总峰面积作为判断依据。表3数据表明，条件4#时总峰面积最大。因此分析条件最终优化如下:检测器温度250℃、进样口温度240℃、载气流速1.0mL/min。在此条件下，对混标分析GC-FID分析，得到图1，图1中各组分间分离完全，谱峰对称性好。

3.4 线性关系和检测限

按上述分析条件对系列混标工作液进行测定，测定各组分的峰面积 (A)，用峰面积 (A)对其质量浓度 (ρ)进行线性回归，结果发现，对于每个组分，峰面积 (A)在一定质量浓度 (ρ)范围内均与其质量浓度 (ρ)线性相关，表4给出了各组分的线性关系。检出限 (LOD)按公式LOD=3Sb/b计算，其中Sb为空白值标准偏差，它通过20次平行测试得到，b为方法校准曲线的斜率，各组分的检出限为0.05 ～0.50 mg/kg。

表4 方法的线性关系和检出限 (LOD)

表5 精密度实验 (mg/kg)

3.5 回收率和精密度

方法的精密度通过对1个自制皮革阳性样品 (该样品中含 有 DEGDEE、 DEGDME、 EGDBE、 EGDEE、 EGDME、NMP)进行9次平行样测试而得到，结果见表5，各组分的精密度为1.76 ～4.18%。

以不含目标分析物的牛二层皮为空白基质，分别添加2倍LOD、10倍LOD、20倍LOD浓度水平的混标，每个添加水平各制备9个平行样，按上述方法进行测定，计算各组分的回收率和平均回收率，结果表明，方法的平均回收率为81.65 ～95.84%。

3.6 实际样品测试

应用本文建立的方法对市售皮革及其制品中残留的有害有机溶剂进行测定，测试对象共512个，其中牛皮革样品76个、猪皮革样品32个、羊皮革样品53个、牛皮革制品243个、猪皮革制品29个、羊皮革制品53个，在其中39个样品中检出了不同含量的目标分析物，检出组分共有DEGBE、DEGEE、EGBE、 EGEE、 TEGBE、 TEGME、 DMA、 DMF、NMP等9种，其中NMP、EGEE、DMA、DMF等4种有机溶剂属于 SVHC物质，NMP、EGEE、DMA、DMF、DEGBE、EGBE等6种有机溶剂属于REACH法规限用物质。各组分的检出次数分别为5(DMA)、30(DMF)、39(DEGBE)、20(DEGEE)、16(EGBE)、16(EGEE)、10(NMP)、11(TEGBE)、1次 (TEGME)，检出率分别为 1.5、5.9、7.6、3.9、3.1、3.1、2.0、2.1、0.2%。各组分检出的含量为2.8 ～453.5 mg/kg，含量最高的是 DEGBE，达453.5 mg/kg，该数值虽低于REACH法规的限量值 (1000 mg/kg)，但应引起足够重视。图2是1个黑色羊皮革样品的GC-FID图，该样品中检出了 DMF、DEGBE和 DEGEE，其含量分别为60.5、17.2、15.6 mg/kg。

图2 实际样品的GC-FID图

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