杜仲叶总黄酮降血脂作用研究

雷燕妮，张小斌

(商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000)

杜仲叶(Eucommia folium)为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥叶，为2010版《中国药典》收载品，夏、秋二季枝叶茂盛时采收，晒干或低温烘干。气微，味微苦，具有补肝肾、强筋骨之功效［1］。研究发现杜仲主要有效成分为黄酮类、环烯醚萜类、木质素、杜仲胶等成分［2］。邓素兰等［3］研究表明杜仲叶中黄酮类成分含量丰富，且在民间常有饮用杜仲嫩叶茶来调节血脂的报道［4］。现代药理学研究表明，杜仲具有降血脂、抗肿瘤及免疫调节等药理作用［5］。关于杜仲药理作用研究已相当成熟，而对杜仲叶的研究则成为了热点。

近些年来，随着人们生活水平的日益提高，由饮食习惯而导致的高血脂、脂肪肝等疾病的发病率正逐年增加，目前，除了饮食控制和强化体育锻炼之外，就是依靠药物治疗［6］。然而，理想的治疗高血脂的药物在目前仍然比较匮乏。本实验通过建立大鼠高血脂模型，以非诺贝特为阳性对照药，观察杜仲叶总黄酮(Total Flavonoids of Eucommia Folium，TFEF)对高血脂动物模型的降血脂作用，以期为进一步开发治疗高血脂药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性 Wistar大鼠，体重为120～250 g，SPF级，购于陕西医药控股集团生物制品有限公司，生产许可证号:SCXK(陕)2008-005;使用许可证号:SYXK(陕)2008-006。

1.2 药物与试剂

杜仲(购于商洛市香菊制药公司，产地商洛，经陕西省商洛市中药材GAP科研工程中心张小斌教授鉴定为杜仲科植物杜仲的树叶)。芦丁对照品(中国食品药品检定研究院);速眠新Ⅱ注射液(吉林省敦化市圣达动物药品有限公司，批号:20120404);非诺贝特(北京京丰制药有限公司，批号:100603);甲基硫氧嘧啶(江苏常州康普药业有限公司，批号:20020366);胆固醇、牛磺胆酸钠(西安绿郡生物科技有限公司);猪油(市售板油熬制);乙腈、甲醇、甲酸、冰醋酸(天津天力化学试剂厂);甘油三酯测定试剂(浙江东瓯生物工程有限公司，批号:200305002);总胆固醇测定试剂(咸宁吉斯生物科技有限公司，批号:20090428);高密度脂蛋白胆固醇(上海荣盛生物技术有限公司，批号:2401199);低密度脂蛋白胆固醇(上海荣盛生物技术有限公司，批号:2401196);水为自制纯水，其他试剂均为化学分析纯。

1.3 仪器

MK3酶标分析仪，美国热电公司;LC-2010型高效液相色谱仪，日本岛津公司;759CRT型紫外可见分光光度计，上海荆和分析仪器有限公司;ACS-ZE01型电子计重秤，杭州万特衡器有限公司;HH-600型数显三用恒温水箱，江苏省金坛市友联仪器研究所;DV114C型电子天平，美国奥豪斯;ZH-B6大鼠代谢笼，淮北正华生物仪器设备有限公司。

1.4 杜仲叶总黄酮的制备及组成分析

1.4.1 杜仲叶总黄酮的制备 以超声波辅助法提取杜仲叶总黄酮［7］，按照料液比(g/mL)1∶15，超声浸提时间2 h，反复浸提3次，超声功率0.45 W/cm2，再采用柱层析法进行纯化。

1.4.2 杜仲叶总黄酮组成分析 参照郭孝武［8］所用方法测定杜仲叶总黄酮含量。采用HPLC法测定黄酮类成分组成及其含量，具体方法参照2010 版《中国药典》［1］。

1.5 高血脂动物模型的建立

取健康Wistar大鼠35只，体重110～170 g，常规饲养，自由取食、饮水一周后观察，无异常，随机分为两组:5只为正常对照组，30只为造模组，两组均以基础饲料饲喂。参照刘建文［9］所用方法制备:高脂饲料(4%的胆固醇、10%的猪油、0.2%的甲基硫氧嘧啶和86%的基础饲料)，饲喂7～10天即可形成明显的高脂血症。造模组每天同一时间饲喂等量的高脂饲料，正常对照组在每天同一时间饲喂相等数量的基础饲料，连续喂到第10天，参照文献［10］中1.2.2的方法判断造模是否成功［10］，随后，在造模组中挑选25只造模成功的大鼠，以开展后续实验。

1.6 进行动物分组、给药及样品处理

1.6.1 将动物分组及其给药剂量 把已经成功造模的高血脂大鼠平均分为5组，每组6只，分别为:模型组、阳性组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，每天定时给模型组和阳性组两个对照组饲喂等体积的蒸馏水，分别用90，30，10 mg/(kg·d)的杜仲叶总黄酮对给药组大鼠灌胃，给予阳性药对照组15 mg/(kg·d)非诺贝特，连续给药30天。

1.6.2 动物给药及处理 给药过程中，除正常对照组外，其余各组上午继续给予高脂饲料5 g/100 g。

给药方式:各组大鼠每天灌胃给予供试药品1次(阳性对照药物以及不同剂量的杜仲总黄酮)，灌胃量为1.5 mL/100 g体重，连续给药30天。

平时观察并进行记录:在代谢笼中饲养大鼠，将各实验组大鼠的活动情况每天定期观察，并记录其进食量与进水量，于每周同一时间称量大鼠体重;最后一次给药结束后，将各组大鼠禁食14小时，再次进行体重称量之后处死，麻醉(肌肉注射速眠新Ⅱ)，抽取其新鲜血液，并将血清分离，将其肝脏组织取出后制成组织匀浆，分别用1.2中试剂盒测定大鼠血清和肝脏相关指标［11-14］。

1.7 血脂指标测定

所有血液和肝组织指标均采用试剂盒检测，严格按照试剂盒操作说明进行，以酶法或比色法测定。

1.8 数据处理

剔除异常数值，所有实验数据采用SPSS 17.0进行分析，结果均以“均数±标准差”表示，对数据进行t检验。

2 结果与分析

2.1 杜仲叶总黄酮成分分析

杜仲叶中黄酮得率为20.3%，比色法测得制备的杜仲叶黄酮提取物的质量分数为83.7%，纯度相对较高。杜仲叶总黄酮的HPLC分析见图1，可见杜仲叶总黄酮主要由4种成分组成，分别是山奈酚、槲皮素、紫云英苷和芦丁。

图1 杜仲叶总黄酮HPLC图Fig.1 The total flavonoids from Eucommia ulmoides leaves HPLC diagram

2.2 杜仲叶总黄酮对大鼠体重的影响

在整个试验中，所有试验动物均能正常生长，活动情况亦未出现异常现象，无异常死亡情况。各组试验动物数量均控制在5～8只范围内，使其符合药理活性实验的要求。最后，全部大鼠处理均符合实验动物伦理学要求。从表1可以看出，各组大鼠体重均有所增加，但各组间每周平均体重差异不明显(P＞0.05)。与模型对照组比较发现，在试验结束之前，禁食后高剂量组的最终体重有显著降低(P＜0.05)，其余各组无显著性差异(P ＞0.05)。

表1 杜仲叶总黄酮对大鼠体重的影响Tab.1 Effect of total flavonoids of Eucommia ulmoides leaves on weight of rats(x ±s，g，n=6)

2.3 杜仲叶总黄酮对高血脂大鼠血脂指标的影响

试验结束之后，经过对样品进一步处理和检测发现，与正常对照组比较，各模型组均有显著性或极显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，说明本次成功完成造模试验。经过对大鼠喂食杜仲叶总黄酮一个月，对比给药组(高、中、低剂量组和阳性组)与模型组中的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白以及载脂蛋白B含量，以上各成分含量均有不同程度降低(P＜0.05或P＜0.01);而高密度脂蛋白和载脂蛋白A则有不同程度升高，如表2和表3。当给药剂量为75 mg·kg-1时，TC，HDL-C和LP-a指标水平均高于正常组，而TG，LDL-C，APo-A和APo-B的水平略低于正常组;同时，与相同剂量的阳性药物相比，给药组的降血脂作用要稍逊一筹，但无显著性差异(P＞0.05)。

表2 杜仲叶总黄酮对大鼠血脂水平的影响Tab.2 Effect of total flavonoids of Eucommia ulmoides leaf on serum lipid level in rats(x ± s，mmol·L-1，n=6)

表3 杜仲叶总黄酮对大鼠血脂水平的影响Tab.3 Effect of total flavonoids of Eucommia ulmoides leaf on serum lipid level in rats(x ± s，mmol·L-1，n=6)

2.4 杜仲叶总黄酮对高血脂大鼠肝脏组织中脂质含量的影响

由表4可见，在模型组中，大鼠肝脏组织中的总胆固醇和甘油三酯含量与正常组比较，有显著增高(P＜0.05或P＜0.01);在阳性对照组及杜仲叶总黄酮给药组(高、中剂量组)与正常组相比较，其肝脏组织中甘油三酯和总胆固醇含量有显著降低(P＜0.05或P＜0.01);而与模型组相比较，正常组肝脏组织中的所有指标均低于其他组。另外，肝脏指数无明显变化。

表4 杜仲叶总黄酮对大鼠肝组织中脂质含量及肝脏指数的影响Tab.4 Effect of total flavonoids of Eucommia ulmoides leaveson lipid content and index of liver in rat liver(x ± s，n=6)

3 结论与讨论

中药复方治疗高血脂，辨证施治，可达到标本兼治的目的，其降脂作用缓和且药效持久，副作用小。因而，研制出具有降高血脂的新型中药就显得很有必要［6］。

现代研究表明，血脂长期过高，易引发动脉粥样硬化和冠心病等心脑血管疾病。动脉硬化通常不易察觉，通过不定期检查血液中有关血脂指标含量，可及时发现并预防动脉硬化。通过对实验性高血脂大鼠血脂水平的检测研究，与模型对照组相比较，发现杜仲叶总黄酮剂量组能够明显改善高血脂大鼠的血脂水平，并且呈现一定的量-效关系，表明杜仲叶总黄酮具有较好的降血脂作用。综上所述，杜仲叶总黄酮具有降低高血脂模型大鼠血脂水平的作用。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010版1部［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:154-155.

［2］ 程光丽.杜仲有效成分分析及药理学研究进展［J］.中成药，2006，28(5):723-725.

［3］ 邓素兰，余继宏，管林.杜仲不同部位总黄酮含量的测定［J］.生物化学工程，2007，41(3):37-38.

［4］ 张瑛朝，张廷敏，郭代立，等.复方杜仲叶合剂对人体降压作用的实验研究［J］.中成药，2001，23(6):418-421.

［5］ 彭红梅，李小姝.杜仲药理作用研究现状及应用展望［J］.中医学报，2013，28(1):72-73.

［6］ 武聪.人参皂苷降解物对高血压高血脂大鼠心肝肾的形态学研究［J］.吉林大学学报(医学版)，2007，33(2):1-5.

［7］ 袁英髦，曹雁平.超声波辅助提取杜仲皮中的杜仲胶和杜仲黄酮［J］.食品科学技术学报，2014，32(2):67-71.

［8］ 郭孝武.超声提取杜仲中黄酮类物质工艺研究［J］.陕西师范大学学报(自然科学版)，2005，32(2):67-71.

［9］ 刘建文.药理实验方法学:新技术与新方法［M］.北京:化学工业出版社，2008:259-276.

［10］雷燕妮.黄芩总黄酮对高血脂大鼠的降血脂作用研究［J］.动物医学进展，2014，35(7):61-65.

［11］刘建文.药理实验方法学:新技术与新方法［M］.北京:化学工业出版社，2008:279-288.

［12］徐超，王鸿飞，邵兴锋，等.香榧子油抗氧化活性及降血脂功能研究［J］.中国粮油学报，2012，27(8):43-47.

［13］周素梅，盛清凯，路长喜，等.不同燕麦品种的辅助降血脂功效研究［J］.中国粮油学报，2011，26(3):25-29.

［14］ EVERSON G T.Bile acid metabolism and its role in human cholesterol balance［J］.Semin Liver Dis，1992，12(4):420-428.