桑黄菌丝体对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

雷 萍，吴亚召，张文隽，宋延平，杜 芳，杨 洁，谢婷婷，李玲梅

(1.陕西省微生物研究所，陕西西安 710043;2.陕西省中医药研究院，陕西西安 712000)

肿瘤是在各种致癌因素作用下，机体在基因水平上局部组织的某一个细胞失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。目前，肿瘤的治疗方法主要有以下几类:外科治疗，肿瘤的外科治疗即手术治疗，是治疗某些肿瘤的最有效的方法，是肿瘤治疗较为传统的方法之一，化疗和放疗，化疗是用化学药物［1］进行治疗，属于肿瘤的全身治疗方法，放疗，俗称“烤电”“照光”，是利用电离辐射来治疗肿瘤的一种方法;生物疗法，是通过生物反应修饰剂(BRM)对肿瘤进行治疗，反应修饰剂主要包括细胞因子、免疫活性细胞、单克隆抗体及其偶联物、肿瘤分于疫苗等;中医药治疗肿瘤，中医药治疗运用整体观念、正邪学说、辩证理论等高度概括了肿瘤的发病机理和病程转归，对肿瘤的治疗起着重要的指导意义。在这几种主要治疗方法中，中医药治疗肿瘤越来越受到人们的重视。

桑黄菌(Phellinus ignairius)又名裂蹄木层孔菌，是一种多年生珍贵药用真菌［2-3］。子实体单生，主要生长于桑树、杨树、白桦树等阔叶树的枯立木树干上［4］。桑黄寄生树种不同，颜色、形状以及所含有效活性成分亦不同［5］。桑黄菌味微苦，桑黄子实体具很好的抗癌活性，含落叶松蕈酸、麦角甾醇等。日本人 Ikekaw T等［6］在1968年发现，桑黄野生子实体的水提取物对小鼠肉瘤S180的抑制率为 96.7%，Sasaki T［7］等发现桑黄发挥抗癌作用的单体物质为多糖，桑黄多糖具有促使肿瘤细胞自我毁灭的诱导细胞自杀活性作用，可以防止肿瘤细胞附着于体内，同时拥有肿瘤转移作用［8］。温克［9］等人以小鼠胃癌和 S180肉瘤为模型，研究比较桑黄、灵芝、阿加里斯茸PL-2，PL-5的抗癌活性，结果显示桑黄在4种药物中有较好的抑瘤作用，分别为43.09%和46.07%。桑黄是目前国际公认的抗癌效果较好的大型真菌之一［10］。Ajijh.t.a等研究了桑黄乙酸乙酯、甲醇和水的提取物，然后用来分别抗Dalton淋巴腹水癌和Ehrlich腹水癌，发现水提物对它们没有细胞毒素作用，而这3个提取物对DLA引起的小鼠肿瘤细胞有着显著的生长抑制作用。桑黄产品作为抗肿瘤药物具有极大的药用价值和开发潜力［11］。桑黄菌丝体可通过发酵工程大规模生产，克服子实体资源匮乏的缺点。

1 材料与方法

1.1 实验动物与瘤株

1.1.1 实验动物 清洁级KM小鼠，50×3只，雌性或雄性，体重20±2g，购于西安交通大学实验动物中心。动物合格证号:0012286;0012296;0011714。

所有实验动物均给予小鼠标准颗粒饲料，实验在二级动物室进行，净化室温度在20～25℃;相对湿度在40% ～70%。门窗密闭，使用空气净化系统，送新风全口开启，送风机隔日换机一次，人流和废弃物等按规定的方向运行，不得逆转。试验结束后，对处死动物的尸体、垃圾袋装后及时清理。

1.1.2 瘤株 小鼠H22肉瘤细胞:由中国医学科学院药物研究所引进，解放军第四军医大学实验动物中心提供。

1.2 试验药物

100%桑黄菌丝体(陕西省微生物研究所菌种资源中心三室，批号20121010)。注射用环磷酰胺(国药准字H14023686，批号04120101，山西普德药业股份有限公司生产)。

1.3 主要仪器设备

BS210S电子天平(精确度0.1 mg，北京赛多利斯天平厂)。XSZ-D2 9818504显微镜(重庆光学仪器厂)。TDL-4型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)等。

1.4 剂量设置及配制

桑黄菌丝体急毒的最大耐受量是15 g/kg，取其1/5作为中剂量，即3.0 g/kg，加一倍为大剂量6.0 g/kg，减一倍为小剂量1.5 g/kg。称取桑黄菌丝粉末6 g，加蒸馏水至20 mL配制成30%桑黄菌丝体混悬液，为大剂量，稀释成为15%，7.5%为中、小剂量，给药体积均为0.2 mL/10 g。环磷酰胺(CTX):按20 mg/kg剂量灌胃给药。

1.5 H22实体瘤小鼠模型的制备

取冻存的肝癌H22细胞瘤株，常规复苏，用PBS调整瘤细胞浓度为1×107/mL，取0.5 mL(活细胞数为5×106)接种于3只小鼠腹腔内，约一周后小鼠出现癌性腹水。待癌性腹水长至7～10 d后无菌抽取癌性腹水，PBS洗涤2次，每次2 000 r/min，离心10 min。离心后弃上清液，显微镜下计数，调整活细胞浓度为1×107个/mL，吹打混匀后备用。按0.2 mL/只接种于小鼠右腋皮下，即为小鼠H22实体瘤模型。需注意配置细胞悬液到小鼠接种完成需在冰域中进行，并在1 h内完成。

1.6 动物分组

接种H22瘤细胞后24h，将动物随机分为5组，每组10只，即模型对照组、阳性药对照组(CTX)、桑黄菌丝体大、中、小剂量组。

1.7 给药剂量

模型对照组按0.2 mL/10 g灌胃给予纯净水，1次/d;阳性对照组按剂量20㎎/㎏灌胃给予环磷酰胺(CTX)，体积为0.2 mL/10 g，1次/d;桑黄菌丝体按上述浓度体积给药，1次/d，连续给药10次。

1.8 测定荷瘤小鼠抑瘤率

末次给药后24h内用拉脱颈椎法处死动物，称重，解剖取瘤，计算肿瘤抑制率。

肿瘤抑制率%=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%

1.9 统计学处理

按上述方法重复3批试验，以验证药物抑瘤效果。每批应用不同性别的动物以消除性别差异的影响，但同一批次的动物必须使用同一性别。

2 结果与分析

结果见表1-表4，结果表明，除环磷酰胺阳性组第一、第三批及3批平均小鼠体重增长明显低于模型组外(P＜0.01)，试验其余各组动物体重均匀增长，模型组肿瘤生长良好。桑黄菌丝体6.0 g/kg，3.0 g/kg，1.5 g/kg 剂量组及环磷酰胺组3批小鼠H22实体瘤生长均明显低于对照组(P＜0.01或 P＜0.05)，平均抑制率分别为43.6% ，36% ，26% ，57.2% 。

表1 桑黄菌丝体对荷H22小鼠实体瘤的抑制作用(±S)第1批♀Tab.1 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice( ± S)The first batch♀

表1 桑黄菌丝体对荷H22小鼠实体瘤的抑制作用(±S)第1批♀Tab.1 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice( ± S)The first batch♀

注:与模型组比较:＊＊P＜0.01

组 别 动物(只)(始/末) 动物体重/g(始/末) 瘤重/g 抑制率/%模型组28.24 10/10 20.9±1.1/26.2±3.0 1.01±0.12 -CTX组 10/10 20.5±0.7/22.2±0.8＊＊ 0.43±0.17＊＊ 57.20大剂量组 10/10 20.8±1.0/24.2±2.7 0.56±0.14＊＊ 44.37中剂量组 10/10 20.4±0.5/24.8±3.7 0.65±0.13＊＊ 34.81小剂量组 10/10 20.7±1.2/24.8±2.1 0.71±0.10＊＊

表2 桑黄菌丝体对荷H22小鼠实体瘤的抑制作用(±S)第2批♂Tab.2 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice( ± S)The second batch♂

表2 桑黄菌丝体对荷H22小鼠实体瘤的抑制作用(±S)第2批♂Tab.2 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice( ± S)The second batch♂

注:与模型组比较:＊＊P＜0.01

组 别 动物(只)(始/末) 动物体重/g(始/末) 瘤重/g 抑制率/%模型组 10/10 20.3±0.9/25.1±3.0 1.12±0.14—27.28 CTX组 10/10 19.8±0.8/23.3±0.9 0.37±0.09＊＊ 65.85大剂量组 10/10 20.0±0.8/25.4±3.2 0.66±0.22＊＊ 40.12中剂量组 10/10 20.0±0.9/26.9±2.5 0.70±0.12＊＊ 36.92小剂量组 10/10 20.0±0.7/26.1±2.2 0.81±0.14＊＊

表3 桑黄菌丝体对荷H22小鼠实体瘤的抑制作用±S)第3批♀Tab.3 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice(± S)The third batch♀

表3 桑黄菌丝体对荷H22小鼠实体瘤的抑制作用±S)第3批♀Tab.3 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice(± S)The third batch♀

注:与模型组比较:＊＊P＜0.01

images/BZ_91_333_2875_2142_2950.png模型组22.84 10/10 19.5±0.8/23.5±2.2 0.90±0.12 -CTX组 10/10 19.5±0.7/21.0±1.5＊＊ 0.40±0.13＊＊ 55.52大剂量组 10/10 19.8±0.6/24.3±1.2 0.48±0.09＊＊ 46.18中剂量组 10/10 20.2±0.8/24.0±1.3 0.52±0.06＊＊ 41.41小剂量组 10/10 19.9±0.7/23.7±1.3 0.69±0.08＊＊

表4 桑黄菌丝体对荷H22小鼠实体瘤的抑制作用±S)(合计)Tab.4 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22tumor-bearing mice ± S)(Total)

表4 桑黄菌丝体对荷H22小鼠实体瘤的抑制作用±S)(合计)Tab.4 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22tumor-bearing mice ± S)(Total)

注:与模型组比较:＊＊ P＜0.01，*P＜0.05

组别 动物(只)(始/末) 动物体重/g(始/末) 瘤重/g 抑制率/%模型组26.12 30/30 20.2±1.1/24.9±2.9 1.01±0.15 -CTX组 30/30 19.9±0.8/22.2±1.4＊＊ 0.40±0.13＊＊ 59.52大剂量组 30/30 20.2±0.9/24.6±2.5 0.57±0.17＊＊ 43.56中剂量组 30/30 20.2±0.8/25.2±2.9 0.62±0.13＊＊ 37.71小剂量组 30/30 20.2±0.9/24.9±2.1 0.74±0.12＊＊

3 结论

试验期间无小鼠死亡，模型组肿瘤生长良好，本品连续给小鼠灌胃给药，3批试验对荷H22小鼠实体瘤的平均抑瘤率达到30%以上，且重复性良好，说明桑黄菌丝体对小鼠H22实体瘤有明显的抑制作用。

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