粒毛盘菌YM404黑色素发酵、纯化及其染色效果

郭赓艺， 蒋 科， 李 兰， 殷坤才， 叶 明

（1.合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.马鞍山市安康菌业有限公司，安徽 马鞍山 243000）

0 引 言

黑色素是通过多羟基酚氧化而成的构造不规则的类多酚聚合体［1］，存在于动物、植物及微生物中，通常对温度、pH 值、光照等较稳定［2－3］。利用微生物发酵产黑色素，成本较低，易于工业化。目前人们提取黑色素常用的方法是碱提酸沉法，但难以获得黑色素的单一组分，对其进行结构解析比较困难［4］。研究表明，采用分级分离的方法可以获得黑色素均一性组分［5］。

目前市场上销售的染发剂多为氧化型染发剂，其主要原料对苯二胺及其衍生物具有一定的毒性、致敏性以及致癌性，长期使用可能导致癌症［6］。有学者以五倍子、黑芝麻、儿茶等原料制备染发剂，但其提取液对天然白发的染发效果较差［7］。因此，研究与开发天然染料的无毒染发剂具有重要的应用价值。

粒毛盘菌属为腐生性真菌，深层发酵后可产生黑色素，但得率较低［8］。目前关于粒毛盘菌黑色素均一性组分的报道并不多。本文对粒毛盘菌YM404产黑色素的发酵条件进行研究，经分级分离后获得其胞外黑色的均一性组分，对其染色效果进行了评价，为粒毛盘菌黑色素资源的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

粒毛盘菌Lachnum YM－404菌株，子实体采集自中国云南省，由合肥工业大学微生物资源与应用研究室分离保藏。

1.2 培养基

固 体 培 养 基：ρ（葡 萄 糖）＝20g／L，ρ（酵母膏）＝5g／L，ρ（蛋 白 胨 ）＝ 5g／L，ρ（琼脂）＝15g／L。

液体发酵基础培养基：ρ（葡萄糖）＝20g／L，ρ（蛋白胨）＝5g／L，V（蒸馏水）＝1 000mL。

1.3 试剂与仪器

葡聚糖凝胶 Sephadex G－100，购自美国Pharmacia公司；海飞丝去屑洗发露，广州宝洁有限公司；其他试剂均为分析纯，购自合肥博美生物科技有限责任公司。

立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；ZHWY－2102气浴摇床，苏州净化设备有限公司；冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；752紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；ACQUITY UPLC LUT液质联用仪，美国Waters公司。

1.4 黑色素发酵条件

用打孔器接种直径6mm、菌龄一致的YM404菌块于装有150mL液体发酵基础培养基的250mL三角瓶中，26℃、160r／min培养10d。发酵液抽滤2～3次，收集发酵液，在520nm处测定其吸光度值，吸光度值越高，表明黑色素产量越高。菌丝体在50℃下烘干并且测定生物量（即菌丝体干质量），生物量越大，表明YM404生长速度越快。以吸光度值和生物量为指标，考察不同碳源（葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉）、氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏）以及不同浓度L－DOPA、谷胱甘肽对YM404生长及产黑色素的影响，确定最佳发酵条件［8］。

1.5 分级分离

［9］的方法，获得粒毛盘菌 YM404黑色素（LEM404）。参考文献［7］的方法，采用葡聚糖G－100凝胶柱，以0.5%NaCO3为洗脱液，LEM404的质量浓度为20mg／mL，进样量为1mL，控制流速为300μL／min，每管收集5mL，柱温保持20℃。收集洗脱液于520nm下测定吸光度值，绘制其洗脱曲线。收集主要组分经减压浓缩后，于截留分子量为200Da的透析袋中透析48h，冷冻干燥后获得LEM404的均一组分。

1.6 质谱分析

采用质谱联用仪对LEM 404均一组分（LEM404－a）进行质谱分析。分析条件［10］：电喷雾离子源，离子源温度为110℃；扫描方式为正离子V模式；质核比的扫描范围为100～1 000；毛细管电压为2 400kV；去溶剂温度为350℃；去溶剂气流量为600L／h；锥孔电压为60V；锥孔气流量为40L／h。

1.7 染色效果

参考文献［11］的方法配制染发剂（A剂、B剂），其中配方I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ以及Ⅴ的A剂水相中的LEM 404－a和对苯二胺的添加量见表1所列，其他成分与文献［11］一致；配方Ⅵ只添加0.8%LEM 404－a。取同一人的白发分别浸入各配方的染发剂中，于35℃恒温箱保温30min，观察染色结果。然后将染色后的头发浸入洗发剂（2mL洗发露与50mL蒸馏水混合）中自然保温24h，观察其是否褪色［2］。

表1 各配方中LEM 404－a和对苯二胺的质量分数 %

2 结果与讨论

2.1 YM404黑色素发酵条件研究

2.1.1 碳源对生物量及黑色素产量的影响

以麦芽糖作为碳源时，YM404菌株发酵液520nm处的吸光度值与生物量均最高，如图1a所示，表明麦芽糖为YM404菌株生长及产黑色素的最适碳源。随着麦芽糖质量浓度的上升，发酵液吸光度值与生物量均呈上升趋势，如图1b所示，当麦芽糖质量分数高于25g／L时，两者均趋于稳定，选取麦芽糖最佳质量浓度为25g／L。

图1 碳源和麦芽糖对YM404生物量及黑色素产量的影响

2.1.2 氮源对生物量及黑色素产量的影响

氮源对YM404菌株生物量及黑色素产量的影响如图2所示。

从图2可看出，以酵母膏作为氮源时，发酵液在520nm处吸光度值最高。而以蛋白胨作为氮源时YM404菌株生物量达最大，但吸光度值较低。由于实验的主要目的在于提高黑色素的得率，因此以吸光度值为主要指标，选择酵母膏作为最适氮源。随着酵母膏质量浓度上升，发酵液吸光度值与生物量均呈上升趋势，当酵母膏的质量浓度高于6g／L时，两者均趋于稳定，选取酵母膏最佳质量浓度为6g／L。

图2 氮源及酵母膏对YM404菌株生物量及黑色素产量的影响

2.1.3 L－DOPA与谷胱甘肽对YM404的影响

研究表明，二羟基苯丙氨酸（DOPA）和谷胱甘肽为黑色素合成途径的中间产物［12］，在发酵液中添加L－DOPA与谷胱甘肽，可能对YM404黑色素产量有一定影响，如图3所示。

从图3a可以看出，不添加L－DOPA的空白对照组的吸光度值为0.327，生物量为0.927g。随着L－DOPA浓度的增加，发酵液的吸光度与生物量均呈先上升后下降趋势，当L－DOPA的浓度为1.25mmol／L时，发酵液吸光度值达到最大，为0.557，当浓度为0.75mmol／L时，生物量最大，为1.231g。这表明添加适量的L－DOPA有益于YM404菌株生长及黑色素的积累，过量时则起抑制作用。

图3 L－DOPA与谷胱甘肽浓度对YM404生物量及黑色素产量的影响

由图3b可看出，不添加谷胱甘肽的空白对照组的吸光度为0.351，生物量为0.827g。随着谷胱甘肽浓度的增加，YM404发酵液吸光度值与生物量均呈先上升后下降趋势，当浓度为0.75mmol／L时，吸光度和生物量都达到最大。当谷胱甘肽浓度继续增大时，吸光度值与生物量下降，表明过量添加谷胱甘肽会抑制YM404菌株生长及黑色素积累。与L－DOPA对YM404菌株生长及产黑色素的影响相比，添加谷胱甘肽对其影响较不显著，因此选择在培养基中添加1.25mmol／L L－DOPA。

综上所述，确定LEM404的最佳发酵条件如下：麦芽糖质量浓度为30g／L，酵母膏质量浓度为 6g／L，L－DOPA 浓 度 为 1.25mmol／L，160r／min，26℃恒温振荡培养10d。采用上述条件发酵粒毛盘菌YM404，可得LEM404的得率为3.45g／L。

2.2 LEM404的分级分离

LEM404经葡聚糖G－100凝胶柱洗脱，在第1～20管内出现1个吸收峰，如图4所示，收集前20管洗脱液，经透析、冷冻干燥后得均一性黑色素LEM404－a，其占LEM404总量的43.7%。

图4 LEM404葡聚糖凝胶洗脱曲线

2.3 LEM404－a的质谱分析

LEM404－a质谱如图5所示，图5中，［M］＋、［M＋H］＋的准分子离子峰的质核比分别为432.18和433.18，可确定LEM404－a的分子量为432.18。

图5 LEM404－a质谱图

2.4 LEM404的染色效果

各配方染发剂的染色效果见表2所列。表2表明，添加LEM404－a有助于提高染发剂的染色效果，并可减少对苯二胺的使用量；当保持对苯二胺的质量分数不变时，增加LEM404－a的量，可获得最佳染色效果；而仅以LEM404－a溶液作为染发剂几乎不着色，这是由于天然黑色素较难渗透到皮层，导致其牢固度不理想，因此需少量添加对苯二胺作为渗透剂辅助染色［6］。

本研究配方Ⅴ中对苯二胺的质量分数仅为0.2%，远低于行业标准（＜6%），也低于市场上现有的天然染发剂中对苯二胺的平均质量分数（约为1%）［13］，表明以LEM404－a为原料制备的配方Ⅴ染发剂具有染色效果好且毒性低的优点。

表2 LEM404－a的染色效果

3 结 论

粒毛盘菌YM404产胞外黑色素的发酵条件为：ρ（麦芽糖）＝30g／L，ρ（酵母膏）＝6g／L，c（L－DOPA）＝1.25mmol／L，得率为3.45g／L；LEM404经分级分离后，获得均一性黑色素LEM404－a，其占LEM404总量的43.7%，相对分子质量为432.18，表明葡聚糖凝胶柱分级分离的方法可获得黑色素均一性组分；LEM404－a本身染色效果差，但以其为原料，添加少量对苯二胺（0.2%）制备的染发剂染色效果好且毒性低，是一种安全有效的染发剂，具有广阔的市场应用前景。

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