一株抗生素制药工业废水高效降解菌筛选及生物特性研究

王俊峰，尹 尧，陈玉花，加春生，王晓楠

(1.黑龙江农业工程职业学院，黑龙江哈尔滨150088;2.哈药集团生物疫苗有限公司，黑龙江哈尔滨150025)

近年来，随着抗生素制药工业的快速发展，抗生素工业废水已成为严重危害人类健康和生态环境平衡的棘手问题，对抗生素制药工业废水进行有效处理已经刻不容缓，成为制约社会可持续发展的紧要问题［1］。抗生素生产过程中产生大量的发酵液、酸废水、碱废水和有机溶剂废水等。其具有有机物浓度高、存在生物毒性物质、色度高、气味重、pH波动大等特征［2］。目前，抗生素制约工业废水处理方法主要有化学处理法、物化处理法(包括混凝－沉淀法、反渗透－膜分离法、吸附法、光降解法、包埋法及电解法等)、生物处理法以及多种方法复合处理等。其中生物处理方法具有处理条件较为温和、微生物适应性较强、费用低廉、较易培养等优点，现已广泛应用于抗生素制药工业废水的处理［3］。笔者试图从抗生素废水处理的活性污泥中筛选出具有高效降解能力的菌株，并研究其生物降解特性，应用于实际生产，以期为抗生素类工业废水高效处理提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 水样 试验水样取自哈尔滨某制药企业废水排放口，活性污泥取自曝气池的回流污泥。

1.2 培养 基 ①无机盐培养基:KH2PO40.9 g/L，Na2HPO4·12H2O 6.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，(NH4)2SO40.4 g/L，微量元素1 ml，121℃高压蒸汽灭菌20 min。②LB培养基:蛋白胨10.0 g/L，酵母膏 5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，固体培养基中琼脂含量为1.5%。

1.3 试验方法

1.3.1 高效降解菌株的分离筛选。(1)增殖培养:取2 ml活性污泥沉淀的上清液，接种到装液量200 ml的三角瓶中，于30℃、100 r/min下培养48 h，而后进行琼脂平板划线分离，分离得到的单菌落经多次反复分离、纯化后得到纯菌株［4］。

(2)菌株筛选:将分离纯化得到的菌落特征较典型、性状较优良的纯菌株分别接种到含50%废水的无机盐培养基中，于30℃、100 r/min条件下培养48 h，根据菌体的生长情况和对COD的去除率，筛选出降解率高的优势菌株［5－6］。

1.3.2 菌株的鉴定。(1)形态、培养及生理生化特征鉴定。对纯培养菌株的菌落特征、培养特征和生理生化特征进行观察与鉴定，同时采用透射电镜进行观察［7］。

(2)16SrDNA序列分析法鉴定。以细菌总DNA为模板，选取一对细菌通用引物进行扩增，其核酸序列如下:引物BSF8/20:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(E.coli16s rDNA对应位点为8～27);引物BSR154120:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’(E.coli的16s rDNA对应位点为1541～1522)。PCR反应条件:94℃变性1min，55℃复性1 min，72℃延伸2 min，在此条件下进行30个循环，然后在72℃下保温10 min，测序由大连宝生物工程有限公司完成。将菌株NG3 16s rDNA核酸序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据库进行比对分析(http://ncbi.nlm.nih.govlast)，由 Gen-Bank中得到相关菌株的序列，与该研究所测的序列一起输入Clustalx1.8程序进行DNA同源性序列分析［8］。

1.3.3 生物量与COD测定。生物量用光密度OD600表示，COD的测定用重铬酸钾法［9］。

1.3.4 NG3菌株的生长及降解特性。采用正交试验法研究高效降解菌NG3菌株的生长及降解特性［10］。其正交试验的因素与水平见表1。

表1 NG3菌株正交试验的因素与水平

2 结果与分析

2.1 形态、培养及部分生理生化鉴定结果 NG3菌株为革兰氏阴性菌，好氧，菌体呈杆状，无芽胞，无鞭毛(图1)，菌落呈乳白色，菌落边缘整齐，微凸起，表面及边缘较光滑，黏稠易挑起(图2)，其生理生化特征见表2。

图1 NG3菌株电镜照片

图2 NG3菌株菌落照片

表2 NG3菌株的生理生化特征

2.2 降解菌NG3的16Sr DNA基因PCR扩增和序列分析

2.2.1 PCR扩增和测序结果。以NG3菌株总DNA为模板，用16SrDNA的通用引物进行PCR扩增，得到1条约1.5 kb的片段(图3)。扩增片段经回收、测序，明确该片段大小为1 475 bp。

2.2.2 NG3菌株核酸序列同源性比较。将 NG3菌株16SrDNA测序结果输入GenBank中，利用Blast软件进行序列同源性分析，结果表明，NG3与Acinetobacter(不动杆菌属)的大多数菌种的相似度达到95%以上，其中NG3与菌种Acinetobacter sp.C65的16SrDNA序列相似度达到99%。

图3 16Sr DNA引物PCR扩增结果

2.3 Acinetobacter sp.NG3菌株的生长及降解特性 Acinetobacter sp.NG3菌株正交试验结果见表3。

表3 NG3菌株正交试验结果

由表3可知，Acinetobacter sp.NG3菌株对温度较为敏感，直接影响其抗生素的降解效率，各因素对有机物COD去除率的影响顺序为温度＞摇床转速＞pH;Acinetobacter sp.NG3菌株最佳降解条件是:温度为35℃，摇床转速为150 r/min，初始pH为7.0。

3 结论

该试验通过选择性富集培养，从高浓度抗生素制药工业废水处理的活性污泥中筛选得到一株具有较高抗生素降解能力的优势降解菌NG3，经染色观察、形态特征、培养特征及生理生化特征鉴定和16SrDNA序列分析，最终确定NG3菌株为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。进一步的降解研究表明，Acinetobacter sp.NG3菌株的降解作用受温度影响较敏感，可能是温度影响NG3菌分泌的降解抗生素的代谢酶的活性，其次是转速，通过摇瓶发酵试验表明，转速大小直接影响氧气的供应，pH影响最小。最终确定其最佳降解条件为:温度为35℃，摇床转速为150 r/min，初始pH为7.0。Acineto-bacter sp.NG3菌株是从自然环境中筛选获得的野生型菌株，经发酵优化后其COD去除率达到89.5%，作为工业化大规模处理抗生素制药废水并不一定理想，但可作为出发菌株，通过人工诱变育种的方法筛选COD去除率较高的优势菌株;也可以对其进行基因克隆，利用基因工程的方法构建工程菌，以适合大规模工业化进行抗生素制药废水处理的需要。

［1］巩有奎，张林生.抗生素制药废水处理研究进展［J］.工业水处理，2005，25(12):1 －4.

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