纳米ZnO对小鼠肺的毒性效应

王群林，李岩，许聪，卞伟华，张小华*

(1.滨州医学院临床学院，山东烟台264003;2.滨州医学院附属医院呼吸科，山东滨州256603;3.滨州医学院药学院，山东烟台264003)

纳米氧化锌为一种新型无机多功能材料，是粒径介于1～100 nm的金属氧化物微粒［1］。由于纳米氧化锌具有特殊优异的性能［2］，使其在许多研究领域具有重要应用价值和广阔应用前景。目前，纳米氧化锌已被广泛应用于纺织［3］、化妆品［4］和医药等领域，不可避免地进入自然环境和生命体中［5－6］，但其安全性一直广受争议。研究表明，纳米材料对人类身体健康和周围生态系统可能造成潜在危害，随着纳米毒理学的兴起和发展，纳米氧化锌的生物安全性被相关领域学者关注［7］。笔者利用小鼠腹腔注射纳米氧化锌，通过观察小鼠一般状况(存活率、体重)和肺湿干质量比，观察小鼠肺组织形态学改变，检测支气管肺泡灌洗液及血清中ICAM-1和TNF-α含量变化，以探索纳米氧化锌对小鼠肺毒性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康昆明小鼠，6～8周龄，体重(25±2)g，雌雄各半，购自烟台绿叶制药有限公司。

1.2 试验试剂 纳米氧化锌，购自 Sigma公司(货号96479)，临用前配制浓度83 mg/ml悬浊液;生理盐水，购自滨州医学院;细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的ELISA试剂盒，购自上海太阳生物技术有限公司;其他试剂，均为分析纯，购自商业试剂公司。

1.3 动物分组及处理 取25 g左右健康昆明小鼠22只，将其随机分为空白对照组和试验组，并用电子秤称取各小鼠试验前体重。饲养3 d后，给予试验组小鼠腹腔注射0.15 ml已配制纳米ZnO悬浊液。空白对照组注射0.15 ml生理盐水。连续注射7 d。

1.4 小鼠一般情况观察 观察包括生存状态、生存率和体重改变，注射7 d后继续饲养3 d，然后抓取小鼠称重并麻醉、解剖和取材。

1.5 肺组织病理切片HE染色 各组小鼠腹腔注射生理盐水或纳米ZnO悬浊液后3 d，眼球取血并处死小鼠，开胸取右肺上叶，修剪为小块，迅速固定于4%甲醛溶液中，72 h后进行石蜡切片及常规HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理改变。

1.6 肺组织湿/干质量(W/D)比值 每组小鼠处死后，取全肺，称湿重，然后将小鼠肺置于60℃恒温箱中干燥，72 h后取出称干重，计算肺W/D比值。

1.7 血液及灌洗液炎症因子检测 采用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液及血清中细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。小鼠眼球取血，静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，上清冻存待检。解剖颈部和胸部，气管和右侧肺叶结扎，左侧肺部灌洗，用穿刺针插入气管上端，0.5 ml生理盐水(NS)反复冲洗3遍，3 000 r/min离心10 min，取上清冻存待检。按照ELISA试剂盒说明书(上海太阳生物技术有限公司)操作，每个样本重复3次。

2 结果与分析

2.1 小鼠一般生存状况观察和存活率比较 观察试验过程中对照组小鼠精神状态良好，活动自如，摄食、饮水无明显异常，毛发光亮，反应灵敏;注射纳米氧化锌试验组小鼠出现精神不佳，蜷缩成团，摄食、饮水减少，反应迟钝，活动减少。与正常对照组相比，试验组小鼠存活率降低(表1)。

表1 ZnO纳米颗粒处理对小鼠存活率的影响

由表2可知，与试验前相比，10 d后正常组小鼠平均体重增加10 g左右，试验组小鼠体重增加仅不到2 g。通过比较小鼠生存状况、体重以及存活率状况，考虑试验组小鼠是由于氧化锌纳米粒子对小鼠机体有损伤作用，为纳米氧化锌对机体产生不良反应提供试验依据。

表2 ZnO纳米颗粒处理对小鼠体重的影响 g

2.2 小鼠肺组织病理学观察 从图1可以看出，光镜下对照组可见肺组织结构正常，肺泡内充满气体，少有炎性细胞浸润，肺泡壁较薄，无明显间质增生;与对照组相比，试验组肺组织结构紊乱，肺泡腔可见大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，间质明显增生。据此推测，氧化锌纳米颗粒对小鼠肺组织有损伤，可刺激肺组织产生炎症性改变，影响肺组织结构。

图1 ZnO纳米颗粒处理小鼠肺组织的病理学观察

2.3 小鼠肺W/D比值 由表3可知，试验组小鼠肺组织W/D比值明显高于对照组(P＜0.05)。

表3 各组小鼠肺W/D比值的比较(¯x±s)

2.4 小鼠血清及肺泡灌洗液炎症因子检测结果 由表4可知，与对照组相比，试验组小鼠血清及肺泡灌洗液中炎症因子TNF-ɑ及ICAM-1含量明显升高，差异达显著水平(P＜0.05)。这表明氧化锌纳米粒子可以刺激机体产生炎症反应，促使炎症因子分泌明显增加。

表4 纳米氧化锌颗粒对小鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α和ICAM-1含量的影响(±s，n=9) μg/L

表4 纳米氧化锌颗粒对小鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α和ICAM-1含量的影响(±s，n=9) μg/L

注:*表示与对照组差异显著(P＜0.05)。

组别 血清TNF-α 灌洗液TNF-α 血清ICAM-1 灌洗液ICAM-1对照组132.3 ±10.7 100.5 ±17.2 12.3 ±4.7 14.5 ±2.2试验组 228.8 ±15.6* 200.3 ±4.1* 19.4 ±3.7* 19.9 ±3.4*

3 结论与讨论

纳米氧化锌可以通过口服、吸入、注射或者皮肤渗透等途径进入人体，对人体的各个系统产生影响。据报道，纳米氧化锌颗粒可对人体正常细胞有毒性作用，如可损伤单核细胞系、肺腺癌细胞系、肺成纤维细胞、肝细胞等［8－10］。吴诚等［11］采用孙氏改良寇氏法诱发小鼠急性毒试验，配制6个梯度的纳米氧化锌药液以灌胃方式一次性供给试鼠。结果表明，高剂量纳米氧化锌可对小鼠的肾脏、小肠、肺脏和肝脏等组织器官造成广泛性损伤，并引起严重的瘀血、出血、细胞变性坏死、大量细胞核固缩碎裂等病理变化。Liu等［12］报道3种纳米材料(氧化锌、银、二氧化钛)气管灌注大鼠后均可引起肺部氧化应激损伤。笔者利用纳米氧化锌腹腔内注射小鼠，初步探讨纳米氧化锌颗粒对小鼠肺组织及炎症介质的影响。结果表明，对照组相比，注射纳米氧化锌小鼠生存状态变差、存活率降低、体重减轻，肺的湿干比增高，肺组织出现一定程度损伤，血清、肺泡灌洗液中TNF-α及ICAM-1含量明显升高。综上所述，纳米氧化锌对小鼠产生一定毒性作用，导致小鼠生存状态、肺组织形态学发生改变，同时纳米氧化锌可刺激小鼠机体产生炎性反应，促使炎症因子TNF-α及ICAM-1含量明显升高。纳米氧化锌通过如何机制导致肺损伤是今后进一步研究方向。

［1］DU Y，ZANG M S，HONG J，et al.Structural and optical properties of nanophase zinc oxide［J］.Applied Physics A，2003，76:171 －176.

［2］赵玉岭.纳米材料性质及应用［J］.煤炭科技，2009，28(8):149 －151.

［3］周少余，徐水凌，朱逢佳，等.纳米氧化锌海丝纤维的抗菌和细胞毒性作用［J］.上海纺织科技，2009，37(12):5 －7.

［4］吕瑛，谢嘉颖.防晒剂中纳米氧化锌的安全性研究进展［J］.中国化妆品(行业版)，2011(5):62 －65.

［5］王发园.人工纳米颗粒的植物毒性及其在植物中的吸收和累积［J］.生态毒理学报，2012，7(2):140 －147.

［6］朱小山，朱琳，田胜艳，等.三种金属氧化物纳米颗粒的水生态毒性［J］.生态学报，2008，28(8):3507 －3516.

［7］宋文华，张金洋，高敏苓，等.纳米氧化锌对小鼠的急性毒性效应研究［C］//2008年全国纳米生物和医学学术会议论文集.中国纳米技术学会，江苏省生物医学工程学会，中国生物医学工程学会，2008:196－198.

［8］刘佳蕙，杨胜韬，王海芳，等.纳米氧化锌对人单核细胞系U937的毒性及其机制研究［J］.中华预防医学杂志，2010，44(9):790 －794.

［9］王琳，王莉娟，张芳，等.纳米氧化锌对人肺腺癌细胞A549的毒性［J］.中国科学院研究生院学报，2009，26(1):83－90.

［10］刘鹏鹏，关荣发，程歌，等.纳米氧化锌对人正常肝细胞HL－7702的毒性作用研究［J］.安徽农业科学，2009，37(36):18023 －18026.

［11］吴诚，文利新，袁慧，等.纳米氧化锌对小鼠的毒性试验［J］.粮食与饲料工业，2008(5):38－39.

［12］LIU H，YANG D，YANG H，et al.Comparative study of respiratory tract immune toxicity induced by three sterilisation nanoparticles:silver，zinc oxide and titanium dioxide［J］.JHazard Mater，2013，248/249:478－486.