防治花鳗鲡细菌性疾病的中西药筛选

2014-12-27佟延南王德强李芳远李忠琴

安徽农业科学 2014年31期

佟延南，王德强*，李芳远，李忠琴

(1.海南省海洋与渔业科学院，海南海口570100;2.集美大学水产学院，福建厦门361021)

花鳗鲡(Anguilla marmorata)为脊索动物门、脊椎动物亚门、硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、鳗鲡总目、鳗鲡目、鳗鲡科、鳗鲡属的一种，又称鲈鳗，是世界上鳗鲡属中分布最广泛的一种［1］，北至韩国济州岛、东至小笠原群岛、南至南太平洋的马克萨斯群岛、西至非洲东海岸的纳塔尔均有分布;在我国自钱塘江至海南省各江河水系中都有分布。

花鳗鲡因其市场价格是其他鳗鲡品种的3～5倍，备受养殖者的青睐，盲目的集约化养殖和养殖环境的不断恶化，导致近几年花鳗鲡养殖病害频繁发生，经济损失惨重。以往关于花鳗鲡的研究集中在其分类、地理分布、生活习性、资源调查等方面［2-6］，而在花鳗鲡病害防治药物的研究上极少。笔者以自主分离的花鳗鲡致病菌为研究基础，选择4种中药和3种西药采用琼脂平板稀释法，针对分离的3株花鳗鲡致病菌进行体外抑菌试验，以期为养殖户提供科学、有效的病害防治理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株患病鳗鲡采至海南省海口市大致坡花鳗鲡养殖场，从其内脏(肝脏、肾脏、脾脏等)器官分离、纯化到3株病原菌，由厦门市集美大学水产学院协助，通过生理生化和基因鉴定，3株病原菌分别确定为迟钝爱德华氏菌(Sh1)、嗜水气单胞菌(L2b)、威隆气单胞菌(L2s)。

1.2 试验药材中药:虎杖(Rhizoma polygoni Cuspidati，简称 RPC);大黄(Rheum palmatum Linn.，简称RPL);五倍子(Rhus chinensis Mill.，简称 RCM);黄连 (Coptis chinensis Franch，简称 CCF)。

西药:氟苯尼考(Florfenicol)、阿莫西林(Amoxicillin)、强力霉素(Doxycycline hyclate tablets)。

1.3 中药加工首先，用中药粉碎机粉碎至100目左右，然后放入超微粉碎机进一步粉碎，收集超微药粉备用。在扫描电子显微镜下观察，90%以上的颗粒粒径大小为5～10μm。

1.4 菌悬液的制备将保种的菌液接种于琼脂平板上，置于28℃恒温培养箱内培养20～24 h;挑取单个菌落划线至新鲜斜面上，28℃下培养20～24 h后，用无菌生理盐水将菌体冲洗下来，使用浊度仪将菌液浓度稀释至107CFU/ml，即可作为药敏试验接种的菌悬液。

1.5 中草药抑菌试验采用琼脂稀释法［7］，以中草药为溶质，以营养琼脂培养基为溶剂，配制出2倍浓度梯度的药敏培养基(除五倍子的稀释梯度为 0.50、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 和0.007 812 5 mg/L;其他3 种中草药的稀释梯度为 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 和 0.125 mg/L)。药敏培养基均经过高压灭菌后倒平板，取已调好浓度的菌液2μl接种在含药平板上，每个药物梯度做3组平行试验。将接种好的平板放置28℃培养箱培养24和48 h。

1.6 西药抑菌试验首先用无菌水配置1 mg/ml西药母液，然后以高压灭菌后的营养琼脂培养基为溶剂，采用二倍稀释法配制不同浓度梯度的药敏培养基(浓度梯度为25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 和0.05 μg/L)。取已配制的菌液2μl接种在含药平板上，每个药物梯度做3组平行试验。将接种好的平板放置28℃培养箱培养24和48 h。

1.7 结果观察以24 h无菌落形成的最低浓度为中药对该菌株的最低抑菌浓度(MIC)，以48 h药板上无菌落形成的最低浓度为中药对该菌株的最低杀菌浓度(MBC)。只有2个平行组的MIC值或MBC值一致时，才能界定为抑菌(杀菌)浓度，否则需要进行重复试验。

2 结果与分析

2.1 中草药对3株病原菌的抑制作用比较了4种中药对养殖花鳗鲡3株病原菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。由表1可知，五倍子、大黄、黄连、虎杖对3株致病菌均具有一定的抑制效果，且MIC值和MBC值相等或呈双倍关系。其中，4种中草药对Sh1菌株的MIC值:五倍子＜大黄＜黄连＜虎杖;4种中草药对Sh1菌株的MBC值:五倍子＜大黄＜黄连＜虎杖，五倍子和黄连的MIC值和MBC值相同，大黄和虎杖的MBC值是MIC值的2倍。4种中草药对L2b菌株的MIC值:五倍子＜大黄＜黄连＜虎杖;4种中草药对Sh1菌株的MBC值:五倍子＜大黄＜黄连＜虎杖，五倍子、黄连和虎杖的MIC值和MBC值相同，大黄的MBC值是MIC值的2倍。4种中草药对L2s菌株的MIC值:五倍子＜大黄＜黄连＜虎杖;4种中草药对Sh1菌株的MBC值:五倍子＜大黄＜黄连＜虎杖，五倍子、大黄和黄连的MIC值和MBC值相同，而虎杖的MBC值是MIC值的2倍。

表1 不同中草药3株病原菌的MIC和MBC mg/ml

2.2 西药对3株病原菌的抑制作用比较了3种西药对养殖花鳗鲡3株病原菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。由表2可知，氟苯尼考、阿莫西林和强力霉素对3株致病菌均有良好的抗菌活性，其中强力霉素对Sh1菌株的MIC值最小，达到0.2μg/ml;其次是氟苯尼考、阿莫西林，对Sh1菌株的MIC值分别达到0.8和6.4μg/ml;阿莫西林和强力霉素的MBC值与MIC值相同，氟苯尼考的MBC值为25.6μg/ml。氟苯尼考对L2b菌株的MIC值最小，小于0.05μg/ml;其次是强力霉素、阿莫西林，对L2b菌株的MIC值分别为0.2和6.4 μg/ml;阿莫西林和强力霉素的MBC值与MIC值相同，氟苯尼考的MBC值与MIC值均小于0.05μg/ml。氟苯尼考对L2s菌株的MIC值最小，小于0.05μg/ml，其次是强力霉素、阿莫西林，对L2b菌株的MIC值分别为0.8和3.2μg/ml;阿莫西林和强力霉素的MBC值与MIC值相同，氟苯尼考的MBC值与MIC值均小于0.05 μg/ml。

表2 不同西药对3株病原菌的MIC和MBC μg/ml

3 讨论与结论

3.1 中药对3株花鳗鲡病原菌的抑制作用中草药具有天然性、营养性、毒副作用小、无抗药性等优点［8-9］，其在水产养殖中的主要作用包括:防治疾病、增强免疫力;促进生长，提高饲料利用率;提高存活率;减少应激作用，增加动物的耐受力等作用［10-12］。笔者研究了4种中草药对3株花鳗鲡致病菌的MIC值和MBC值，其平均MIC值大小依次为虎杖＞黄连＞大黄＞五倍子，平均MBC值大小依次为虎杖＞黄连＞大黄＞五倍子。不同中草药对同一菌株的抑制效果不同，其原因可能是不同中药草其抑菌成分不同，如五倍子的主要抑菌成分为丙酮提取物［13］;而黄连的主要抑菌成分为小檗碱［14］。另外，各试验组中有些菌株的MIC值和MBC值略有不同，说明中草药作用于该菌株时，其抑菌浓度和杀菌浓度不同，为今后生产与应用提供理论依据。

3.2 西药对3株花鳗鲡病原菌的抑制作用临床实践表明，抗菌西药对各种细菌性疾病均有良好的疗效。该研究中3种抗菌西药对3株花鳗鲡病原菌均具有较好的杀菌、抑菌效果，其平均MIC值大小依次为阿莫西林＞强力霉素＞氟苯尼考，平均MBC值大小依次为阿莫西林＞强力霉素＞氟苯尼考。但是，同种抗菌药对不同菌株抑菌效果有所差异，氟苯尼考对Sh1抑制效果最差(MIC值为0.8μg/ml)，强力霉素对L2s抑制效果最差(MIC值为0.8μg/ml)，而阿莫西林则对Sh1和L2b抑制效果最差(MIC值为6.4μg/ml)。

该研究中4种中草药和3种西药对花鳗鲡致病菌均有不同程度的抑菌、杀菌效果，但因抗生素经常导致耐药菌株的产生和水产品药物残留等问题［15］，建议在生产实践中多使用中草药或中西药联用，而中西药联用配伍比例有待下一步研究。

［1］李育培，权衡，盛晓洒，等.花鳗鲡生物学特性及人工养殖技术［J］.渔业致富指南，2008(10):50-52.

［2］袁瑛，闵志勇.花鳗鲡的基础生物学研究［J］.水产科学，2005(9):29-31.

［3］齐兴柱，尹绍武，娄甜甜，等.海南产花鳗鲡细胞色素b基因的克隆及序列分析［J］.海南大学学报:自然科学版，2007(4):397-401.

［4］李育培，权衡，盛晓洒，等.花鳗鲡的生物学特性及人工养殖技术［J］.渔业致富指南，2008(10):50-52.

［5］朱友芳，林凤钦，王艺磊，等.3个花鳗鲡地理种群的AFLP分析［J］.海洋科学，2011(8):83-88.

［6］罗鸣钟，关瑞章，李忠琴，等.菲律宾花鳗鲡种类鉴别与形态差异分析［J］.水产科学，2012(6):333-338.

［7］叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程［M］.2版.南京:东南大学出版社，1997:562-565.

［8］农业部《新编渔药手册》编撰委员会.新编渔药手册［M］.北京:中国农业出版社，2005:317-318.

［9］梁用本.中草药在防治鱼病中的应用［J］.渔业致富指南，2004(18):53.

［10］李顺才，杜利强，安瑞永.水产动物中药添加剂的作用机理及应用概况［J］.水利渔业，2007，27(6):102-104.

［11］吕欣荣，肖克宇.中草药在水产养殖病害防治中的应用现状［J］.内陆水产，2007(9):29-31.