体外产气法研究棉酚对瘤胃发酵与微生物蛋白产量的影响

张力莉，徐晓锋

（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）

全棉籽由于具有较均衡的营养物质组成，在奶牛生产中应用广泛，但无论是棉籽饼粕还是全棉籽颗粒，在应用过程中都存在棉酚的毒性问题，会对奶牛造成一定的抗营养作用。本研究通过体外产气法研究棉酚添加对瘤胃发酵的影响。

1 材料与方法

1.1 试验饲料 苜蓿作为体外产气发酵饲料，产自宁夏。苜蓿样品在60℃条件下经48 h烘干，粉碎通过1 mm筛，棉酚购自陕西慈缘生物技术有限公司。

1.2 试验设计

1.2.1 缓冲液配制 每升缓冲液中含Na2HPO41.43 g、KH2PO41.55 g、NaHCO38.75 g、NH4HCO31.00 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、CaCl2·2H2O 3.3 g、MnCl2·4H2O 2.5 g、FeCl2·6H2O 0.2 g、CoCl2·6H2O 0.25 g、Na2S9·H2O 0.37g。

1.2.2 瘤胃液的采集 收集3只装有永久瘤胃瘘管绵羊的瘤胃液。绵羊饲养水平为1.2倍维持水平，日粮精粗比为30∶70，瘤胃液采集时间为早晨饲喂前0.5 h，采集的瘤胃液立即放入保温瓶中带回实验室。

1.2.3 混合培养液的配制 收集的瘤胃液用四层纱布过滤，持续充入CO2气体5 min，与缓冲液的配比为1∶2，然后迅速转移至已预热好并通有CO2的培养瓶内（1 000 mL），保持在39℃水浴中，并混合。200 mg的苜蓿加入到注射器，然后向注射器注入30 mL缓冲瘤胃液，再将1 mL棉酚溶液通过硅胶管注射到注射器 （棉酚浓度分别为0.005、0.01、0.05 mg/mL）。即注射器内棉酚添加到苜蓿中的浓度为0.025、0.05、0.25 mg/kg。 每个处理3个重复。

1.2.4 产气量的测定 从产气开始后，分别于3、6、9、12、24、48、72、96 h 通过玻璃注射器记录一次产气量。

1.3 产气动力学指标计算 参照Φrskov和Mc-Donald（1979）的产气模型公式将样品在 3、6、9、12、24、48、72、96 h 的产气量代入， 应用 Neway curve-fitting程序（麦考利土地利用研究所，2004）计算消化动力学参数（Menke和 Steingas，1988）。

1.4 发酵参数测定 在培养24 h时，每个处理组的3个注射器从培养箱中取出，记录产气量，将注射器的内容物定量转移到50 mL离心管中，并离心分离。收集上清液于-80℃贮存，用于氨氮、挥发性脂肪酸（VFA）的分析。沉淀物进行冷冻干燥、称重并分析微生物嘌呤。约1 g干物质含量的苜蓿培养在125 mL的烧瓶中，加入90 mL缓冲瘤胃液，每个处理3个重复。培养24 h时，将烧瓶置于4℃温度下停止发酵，并通过尼龙袋（100～160 μm）过滤，用于测定干物质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维瘤胃降解率（Dario等，2003）。

1.5 化学分析 干物质和粗灰分的测定参照AOAC（1990）。中性洗涤剂纤维、酸性洗涤纤维测定参照Van Soest（1991）的方法进行测定。挥发性脂肪酸测定参照Getachew等（2001）的方法。NH3-N浓度的测定应用比色方法（Weatherburn，1967）。 微生物蛋白（MCP）测定应用嘌呤碱基法（Zinn 和 Owens，1986）。

1.6 数据分析 数据运用excel 2003进行初步处理，运用SPSS 11.5进行统计分析和Duncan’s多重比较。

2 结果与分析

2.1 棉酚对瘤胃产气参数的影响 从表1可知，添加棉酚显著抑制了瘤胃发酵，产气量呈显著下降趋势，各处理组较未添加组分别降低5.95%、9.48%、18.37%（P＜0.05）；棉酚添加提高了产气延迟时间（P ＜ 0.05），但添加组间差异不显著（P ＞ 0.05）。

2.2 棉酚对体外培养瘤胃降解率的影响 从表2可以看出，随着棉酚添加浓度的提高，体外干物质降解率呈下降趋势，差异显著（P＜0.05），但添加量为0.025 mg/kg与0.05 mg/kg的两组间干物质降解率差异不显著（P＞0.05）。随着棉酚添加浓度的提高，体外中性洗涤纤维降解率呈现出与干物质降解率相同的变化趋势，体外酸性洗涤纤维降解率呈现下降趋势，且组间差异显著（P＜0.05）。

表1 棉酚对瘤胃产气参数的影响

表2 棉酚对体外培养瘤胃干物质、粗纤维降解率的影响

2.3 棉酚对瘤胃发酵参数的影响 由表3可知，棉酚添加浓度的提高导致瘤胃挥发性脂肪酸产量下降 （P＜0.05）， 但 0.025 mg/kg添加组与0.05 mg/kg添加组间差异不显著（P＞0.05）；随着棉酚添加浓度的提高，乙酸、丙酸产量也呈下降趋势，未添加组与添加组间差异显著（P＜0.05）；棉酚添加组较未添加组乙酸与丙酸比显著增加（P ＜ 0.05），但添加组之间差异不显著（P ＞ 0.05）。

表3 棉酚对瘤胃挥发性脂肪酸产量的影响

2.4 棉酚对体外瘤胃发酵微生物蛋白合成的影响 由表4可见，0.025 mg/kg添加水平对微生物合成蛋白效率无显著影响（P＞0.05），但随着添加浓度的提高，瘤胃微生物蛋白合成效率显著降低（P＜0.05），但在0.05 mg/kg添加组与0.25 mg/kg添加组之间无显著差异（P＞0.05）。

3 讨论

反刍动物对棉酚的脱毒，主要是棉酚结合到可溶性蛋白质上的赖氨酸自由氨基（ε-）位点上，即游离棉酚变成结合棉酚，从而使胃肠道不能对其消化吸收（Calhoun等，1995）。研究证实，离心的瘤胃液中赖氨酸与游离棉酚是结合在一起的（Raymond 与 Hwei，1962），由于与棉酚的结合，使日粮难以消化吸收赖氨酸（Randel等，1996）。本研究结果表明，棉酚添加浓度的提高抑制了干物质的降解。孙云章等（2007）试验结果表明，20 mg/L和40 mg/L棉酚处理组瘤胃真菌发酵具有明显的滞后效应，且这种滞后效应随棉酚浓度的增加而愈明显，提示棉酚对真菌发酵具有一定的抑制作用，也证实了棉酚的存在会抑制瘤胃发酵。

表4 棉酚对体外瘤胃发酵微生物蛋白合成的影响

除与氨基酸结合影响到干物质降解率之外，棉酚与矿物质也具有较高的亲和力，铁与棉酚能够结合（Cheeke，1998；Kerr，1989）。 研究表明日粮添加 FeSO4（FeSO4∶棉籽粕，2∶1），使铁离子与棉酚形成了无毒性的物质，降低了棉酚的副作用（Clawson和 Smith，1966）。 游离棉酚也可以与锌结合成结合棉酚，结合棉酚在消化道中不易被消化 （Calhoun等，1995、1991）。 通过以上研究结果可以看出反刍动物日粮棉酚的摄入会对瘤胃内铁、锌浓度及利用造成影响，因为很多酶的辅酶需要铁、锌的参与，这也许是影响到干物质降解的另一可能性因素。

4 结论

本研究通过体外产气法研究了不同棉酚添加浓度对苜蓿瘤胃发酵的影响，结果表明，棉酚的添加会降低苜蓿体外瘤胃降解，同时减少了微生物蛋白合成量。

[1]孙云章，杜改梅，张志成，等.棉酚对瘤胃真菌和细菌体外发酵稻草活力的影响[J].金陵科技学院学报，2007，23：69 ～ 71.

[2]Association of Official Analytical Chemists （AOAC）.Official Methods of analysis[M].14th edn.Washington DC，USA：AOAC，1984.

[3]Calhoun M C，Holmberg C.Safe use of cotton by products as feed ingredients for ruminants.Cattle Research with Gossypol Containing Feeds[M].Memphis in USA：National Cottonseed Products Association，1991.97.

[4]Calhoun M C，Kuhlmann S W，Baldwin B C.Assessing the gossypol status of cattle fed cottonseed products[M].Moscow：Pacific Northwest Anim Nutr Conf，1995.147 ～ 157.

[5]Cheeke P R.Natural toxicants in feeds forages and poisonous plants.2nd Edn[M].DANVILLE：INTERSTAE PUBLISHERS，1998.479.

[6]Clawson A J，Smith H.Effect of Dietary Iron on Gossypol Toxicity and on Residues of Gossypol in Porcine Liver[J].J Nutr，1966，89：66.

[7]Dario C，Fergus L，Mould M，et al.Use of fibrolytic enzymes to improve the nutritive value of ruminant diets A biochemical and in vitro rumen degradation assessment[J].Animal Feed Science and Technology，2003，107：201 ～ 209.

[8]Getachew G，De Peters E J，Robinson P H.In vitro rumen fermentation and gas production：influence of yellow grease，tallow，corn oil and their potassium soaps[J].Animal Feed Sci Technol，2001，93：1 ～ 15.

[9]Kerr L A.Gossypol toxicosis in cattle[J].Br Comp Cont Ed Pract Vet，1989，11：1139 ～ 1146.

[10]Menke K H，Steingas S H.Estimation of the energetic fodders value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid[J].Anim Res，1988，28：7 ～ 55.

[11]Randel R D，Willard S T，Wyse S J，et al.Effect of diet containing free gossypol on follicular development，embryo recovery and corpus luteum function in Brangus heifers treated with bFSH[J].Theriogenology，1996，45：911 ～ 922.

[12]Raymond R，Hwei C F.The mechanism of gossypol detoxification by ruminant animals[J].Journal of nutrition，1962，76：215 ～ 218.

[13]Van Soest P J，Robertson J B，Lewis B A.Methods for dietary fibre，neutral detergent fibre and non-starch polysaccharides in relation to animal nutrition[J].J Dairy Sci，1991，74：3583 ～ 3597.

[14]Weatherburn M W.Phenol-hypochlorite reaction for determination of ammonia[J].Analytical Chemistry，1967，39：971 ～ 974.

[15]Zinn R A，Owens F N.A rapid procedure for purine measurement and its use forestimatingnetruminalproteinsynthesis[J].CanAnimSci，1986，66：157 ～ 166.

[16]фrskov E R，McDonald I.The estimation of protein degradation in the rumen from incubation measurements weighted according to the rate of passage[J].Agric Sci Camb，1979，92：499 ～ 503.