植物促生菌剂对甘草生长影响的研究

马文彬，王占军，姚 拓，张玉霞，王国基

（1.甘肃农业大学 草业学院／草业生态系统教育部重点实验室／甘肃省草业工程实验室／中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；2.宁夏农林科学院荒漠化治理研究所，宁夏 银川750002）

近10年，人类对农产品的需求不断增加，为提高产量致使农业生产中大量施用化肥，中药材栽培中化肥施用量也居高不下。研究证实，各种形态的氮肥施入土壤后，都会形成硝态氮，导致土壤酸化及土壤理化性质恶化，促使土壤中一些有毒有害污染物释放和增加［1，2］。磷肥由于其特殊的加工工艺及原料中含有多种重金属、有害杂质及放射性物质［3，4］，使土壤及作物受污染。2002年6月1日《中药材生产质量管理规范（试行）》（GAP）允许限度使用化学肥料，限量使用高效、低毒、低残留农药。但由于人工栽培的中药材多为多年生药用植物，使用化学肥料势必造成有害成分和重金属在中药材中的蓄积，影响药材品质和下茬作物的种植［5］。有学者研究发现在植物根际存在能够固定空气中的氮气，分解土壤磷素，分泌植物生长激素及防治植物病害等有益微生物菌群，被称为植物根际促生菌［5］（PGPR）。利用PGPR制备的微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用，保护环境以及提高农作物产品品质和食品安全等方面已表现出不可替代的作用［7］。为维持自然界的生态平衡及农业的可持续发展，应用微生物肥料对于中药材GAP种植具有重要意义。

甘草（Glycyrrhizauralensis）为豆科多年生草本植物，地上部分粗蛋白、粗脂肪含量高，粗纤维含量低，因根和茎均能入药［9］，是中医最常用的药物之一，有“十方九草”之称。此外还在食品和轻工业等方面广为应用［10］，同时对干旱地区的防风固沙、绿化荒漠、维护生态平衡等有着重要作用［11］。由于甘草应用广泛，需求量连年上升，加之野生甘草资源的破坏，栽培甘草成为甘草药材的主要来源。

目前，国内外对甘草的研究多集中在化学成分的提取、分离和有效成分的开发及甘草的分类鉴定等方面［12］。此次研究以甘草为研究对象，利用前期从甘草及其他植物根际分离筛选的5株优良促生菌株进行甘草促生试验，测定其对甘草生长的影响，筛选出最优菌株，为甘草GAP栽培及研制甘草根际专用生物肥提供理论和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 供试植物

供试甘草品种为乌拉尔甘草。种子由宁夏农林科学院荒漠化治理研究所提供。

1.2 菌株来源及特征

供试菌株为甘肃农业大学草业学院草地生物多样性实验室提供的5株优良促生菌，其特征见表1。

1.3 培养基及营养液

LB培养基［13］：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1 000mL，pH 7.0。

霍 格 兰 营 养 液［14］：1mol／L MgSO4·7H2O 4mL，1mol／L Ca3（PO4）22mL，1mol／L CaCl2·2H2O 10mL，1mol／L KCl 10mL，Fe·EDTA 2mL，微量元素营养液2mL，Agar 2g。

微量元素营养液配方（500mL）：HBO30.310g，MnSO41.115g，ZnSO4·7H2O 0.430g，NaMoO4·2H2O 0.012 5g，CuSO4·5H2O 0.001 25g，CoCl20.001 25g，KI 0.037 5g。

表1 供试菌株Table1 Strains for test

1.4 研究方法

1.4.1 菌悬液制备 将LB斜面培养基上生长72h的5种菌分别接种于100mL LB液体培养基中，置于28℃，125r／min的摇床培养3～5d，测定D660nm值，使D660nm值均＞0.5，无菌水调节D660nm值一致（使菌数量处于同一水平），制成单一菌悬液。

1.4.2 种植 选取籽粒饱满、大小均一的甘草种子，将种子先用75%的酒精灭菌处理15s，然后，用无菌水冲洗4～5次，再经过0.1%HgCl2灭菌处理10min后，用无菌水冲洗干净，将种子置于灭菌后的水琼脂培养基平板中，置于25℃培养箱（28℃，16h光照，20 000lx，8h黑暗）中培养，待种子芽长1～2cm，将甘草幼苗移至装有40mL无菌Hoagland水琼脂半固体培养基的长玻璃试管（4cm×45cm）中，每个试管1株幼苗，置于培养箱中培养，2d后观察，去除移栽后死亡的幼苗。

1.4.3 接种 将1.4.1中各单一菌悬液1mL在无菌条件下接入1.4.2所培养的幼苗根际，接种后将试管继续置于培养箱中培养。设1组为对照，每个处理5次重复。

1.4.4 测定项目与方法 经过处理的幼苗培养40d后收获，用无菌水洗净根表培养基，测量株高及根长；剪去地上部分，利用根系扫描仪（LA2400Scanner，Epson Expression 1000XL）测定根表面积、根体积及根平均直径；经105℃杀青15min后在70℃下烘干至恒重，分别称量地上和地下部分干重。

1.5 数据处理

利用Excel 2007整理数据，SPSS17.0进行方差分析和主成分分析，采用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 促生菌剂对甘草生长的影响

2.1.1 对株高的影响 通过测定不同促生菌剂对甘草株高的影响表明（表2），接种不同促生菌剂后，甘草株高与对照有显著差异，增幅为17.5%～32.8%，其中Jm92最好，Jm170次之，RP1最差。方差分析表明：Jm170和Jm92与对照相比差异显著（P＜0.05），其他处理之间差异不显著，Jm92对甘草株高的促进作用达到了极显著水平（P＜0.01），较对照增加32.8%；其次为Jm170，较对照增加27.1%；RP1株高小于对照。

2.1.2 对植株生物量的影响 对甘草地上、地下生物量测定表明（表2），促生菌剂对其有明显促进作用，其中地上部分与对照相比增加5.8%～51.5%。Jm92最为显著，RP1促生效果最差，但较对照相比也增加了5.8%。其中Jm92，Jm170和RS5与对照相比差异显著（P＜0.05），而且Jm 92对地上生物量的增加达极显著水平（P＜0.01）。Jm92对地下生物量的促生效果最好，较对照增加202.3%，RS5次之，达到175.6%。Jm92、Jm170和RS5较对照差异达极显著水平（P＜0.01），说明施用促生菌剂可增加甘草的生物量。

2.2 促生菌剂对甘草根系性状的影响

对根表面积、根体积、根平均直径和根长等根系指标测定表明（表3），与对照相比，5个处理分别使甘草根表面 积 增 加 186.2%，117.4%，37.9%，176.8%，168.1%，其中，RS1的处理效果与对照相比差异极显著（P＜0.01），除RP1外，其他处理与对照相比差异显著（P＜0.05）。由此可见，各菌剂处理对甘草根表面积具有显著的增加作用；各处理对根体积的促生效果明显，较对照增加148.5%、130.3%、7.58%、121.2%和180.3%，除RP1以外其余处理较对照差异极显著（P＜0.01）；各处理对根平均直径影响不同，RP1，RS5和Jm92对其直径增加明显，较CK分别增加了36.4%，17.8%和14.7%，RS1和Jm170对直径影响则不及对照，仅RP1与CK差异显著（P＜0.05）。各处理对根长影响不及其他指标显著，但除RP1外均有增加，仅Jm170与对照差异极显著（P＜0.01），达92.4%，其余处理较对照无显著促进作用。

表2 不同促生菌剂下甘草的生长Table2 Effect of PGPR inoculum on growth of Radix glycyrrhizae

表3 不同促生菌剂下甘草的根系性状Table3 Effect of PGPR inoculum on root triaits of Radix glycyrrhizae

2.3 不同促生菌剂对甘草生长的重要性

将供试菌株的根表面积、根体积、根平均直径、根长、株高、地上生物量和地下生物量7个性状作为自变量，进行主成分分析。在7个因子中，前2个因子的累积贡献率已经达到88.075%，因此，在主成分分析中只需取前2个主成分。从综合得分及排名来分析（表4），Jm92最高，促生效果最好；RP1得分最低。

3 讨论

PGPR菌既可帮助植物从环境中摄入养分（如联合固氮），直接促进植物生长，也可通过减轻或预防不良环境因素（如病原菌、重金属等）给植物造成的伤害，从而间接促生［15］，同时可溶解土壤中某些难溶性物质（如溶磷菌），以达到促进植物生长、增加作物产量，并且提高作物品质的效果。近年来，国内外学者就各种接种剂对植物的促生作用进行了大量研究，如荣良燕等［16］研究指出，复合菌肥替代20%化肥用量可使成熟期玉米地上生物量鲜重提高10%，替代20%～30%的化肥可提高4%～8%的籽实产量。胡江春等［17］研究表明，海洋放线菌MB－97对克服重茬大豆连作障碍具有显著作用，对大豆有生长刺激作用，大豆田间试验平均增产15.2%。康贻军等［18］接种PGPR对豇豆幼苗的促生作用认为，浸种处理幼苗的株高及茎叶干物重均有增加。韩文星等［18］在燕麦上接种PGPR菌肥研究发现，PGPR菌肥与半量化肥配施后，燕麦主根长、根体积和根系干重均有明显增加。目前，PGPR的作用机制尚不完全清楚，但有研究认为，PGPR可诱导植物分泌生长素、溶磷菌将土壤中难溶性磷转化为植物可吸收利用的磷、增强植物对病原菌和环境胁迫的抗性和耐受力等［20］。本研究利用前期筛选的优良促生菌株对甘草的促生试验表明，不同接种剂均可增加甘草株高及生物量，这与席琳乔等［20］在燕麦上接种联合固氮菌株后大多数菌株明显促进燕麦生长（株高、根长、根表面积和生物量）的研究结果基本一致。从国内外学者的研究可看出，促生菌肥在田间的应用效果存在着很大差异。有报道接种外源PGPR后，其存活、竞争及促生作用受接种浓度、接种技术和土壤环境等诸多因素的影响，由此也会影响促生效果。本研究在培养基条件下初步筛选甘草根际促生菌，对于如何优化各种因子，以达最佳田间接种效果还需要进一步的深入研究。

表4 甘草主成分得分及综合得分Table4 Principal score and general score

根系是作物吸收水分和养分的重要器官，是最先感受到养分胁迫和逆境胁迫的器官［21］，而根系表面积是根系与土壤之间进行营养交换的界面，根系体积是根与土壤的接触面积，直径增粗可降低由供氮不足引起的细根衰老和死亡的机率［22－23］，因此，根系形态特征与植物利用土壤养分的效率密切相关，且根系表面积大，根体积大是磷高效利用的主要特征［24］。甘草广泛分布于西北具盐渍化土壤、光照强、温差大和多风沙的干旱环境中，药用部分为干燥根及根茎，其地下根茎所占比重大于主根，且主要依靠横走根茎上的休眠芽进行无性繁殖，因此，根系的生长发育对甘草尤为重要。试验研究在甘草幼苗上接种不同促生菌剂后甘草根系表面积、体积及直径增加明显，由此可见，促生菌剂对根系性状的影响充分说明PGPR可增强根系吸收水分、养分的能力，这对于生长在干旱条件下的甘草极为有利。

谭周进等［25］证实磷是植物体内能量传递和转化的重要元素，直接或间接地影响生物固氮和固氮酶活性。研究中选用的菌株Jm92和Jm170有较高的固氮酶活性，能够固定空气中的氮为植物提供氮素，并且具有溶磷作用，因此，较对照菌株生长良好，尤其是这两种菌对于甘草根的影响极为显著，且Jm92优于Jm170，这与菌株的固氮效应有密不可分的关系。而Sigleton等［26］的研究认为，一旦土壤中土著根瘤菌的数量达到一定阈值时，接种根瘤菌并不能产生较大的作用。因此，在土壤环境中或者甘草根瘤存在等有氮条件下，促生菌株的促生效应是下一步研究的重点。

4 结论

供试菌株中Jm92，Jm170和RS1对甘草生长均表现出不同程度的促进作用，在研制甘草根际专用肥中具有较大潜力，但田间的应用效果还需进一步研究。由于PGPR是从植物根际筛选出来，再次回归到植物根际，不仅可减少化肥对土壤的污染及对微生物区系的破坏，还可增加药材产量，避免化肥使用过多而导致的药材安全问题。因此，微生物接种剂的使用具有社会和生态双重意义，为GAP种植开辟新路径。

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