miR-145在胃癌中的表达及其临床意义

杨学文，高 峰，滕凤猛（江苏省中医院／南京中医药大学附属医院检验科，南京 210029）

胃癌患者就诊时多数已处于进展期，其早期病变确诊率不足10%［1］。胃癌的发生通常是一个多步骤、涉及多因素的过程，其机制可能与某些胃癌相关基因的改变有关。microRNAs（miRNA）为内源性非编码单链小分子RNA，长度约为19～24 nt，其异常表达可能参与肿瘤的发生、发展，可作为肿瘤早期诊断及判断预后的指标［2］。目前已有研究证实miR-145在膀胱癌、宫颈癌、肺癌、肝癌及乳腺癌中均有不同程度的表达下调。本研究通过比较miR-145在正常组织及胃癌组织中的表达差异及与胃癌临床病理参数的相关性，探讨miR-145作为胃癌早期诊断的预测价值。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源选择2011年2月至2012年6月本院就诊的67例胃癌患者，均经胃镜检查和活检病理证实。所有患者术前均未接受放疗、化疗以及其他针对肿瘤的特殊治疗，其中男41例，女26例，年龄33～81岁，平均61.2岁。TNM分期以UICC 2010年第7版为标准。取肿瘤边缘外5cm处的非癌胃黏膜作为对照，所有组织标本均置于液氮保存。

1.2 试剂用于RNA提取的Trizol购自Invitrogen公司，RNA反转录试剂盒及SYBR购自Takara公司，miR-145和U6引物由生物工程（上海）股份有限公司加工合成。

1.3 方法取胃癌和胃癌肿瘤边缘外5cm正常组织各100 mg用l mL Trizol浸泡，匀浆器捣碎，经氯仿分离，异丙醇沉淀，75%乙醇清洗，离心后用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，使用NanoDrop ND-1000分光光度计测定浓度后，记录A260／280后-80℃保存。采用Takara公司反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA（miR-145和U6），总体系为10μL，RNA总量小于500ng，37℃孵育15min（85℃孵育5s）。荧光实时定量聚合酶链反应（PCR）总体系为20μL，cDNA总量小于100ng，SYBR 10μL，上游引物10μmol，下游引物10μmol，起始模板变性95℃1min，PCR循环中95℃10s，60℃40s，40个循环。所有样品设置3个复孔，采用2-ΔΔCt法计算miR-145和U6的相对表达量，ΔΔCt=（CtmiR-145-CtU6）胃癌-（CtmiR-145-CtU6）正常。miR-145和U6的反转录引物及上下游引物见表1。

1.4 统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，以α=0.05为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-145在胃癌及正常组织的表达67例胃癌组织标本中仅有13例miR-145表达量高于正常组织，仅占19.40%，其他54例（80.60%）标本中的表达明显低于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 miR-145在胃癌和正常组织中的表达

2.2 miR-145与胃癌临床病理的相关性miR-145在胃癌患者的性别、年龄及不同TNM分期中表达差异无统计学意义（P＞0.05），但是与胃癌患者的组织学分级（χ2=18.135，P＜0.01）及淋巴结转移情况（χ2=31.146，P＜0.01）密切相关，见表2。

表1 miR-145和U6相关引物

表2 miR-145与胃癌临床病理的相关性（n）

3 讨 论

目前有研究证实miR-145可以通过抑制癌基因表达，阻滞细胞周期相关蛋白表达和促进肿瘤细胞的凋亡以达到抑制肿瘤生长的作用。miR-145可以靶向c-MYC、肾素血管紧张素系统（RAS）等多种癌基因，抑制癌基因的表达，从而发挥其抑制肿瘤细胞生长的作用［3-4］。

目前对于miRNA在肿瘤中表达的检测方法存在多样性，张晴等［5］采用原位分子杂交法，检测91例人乳腺癌与38例乳腺良性病变中miR-145表达情况。Schepeler等［6］采用基因芯片技术对49例结肠癌的miRNA谱进行了分析，发现结肠癌组织中miR-145表达水平明显低于周围正常组织。本研究采用miRNA茎环结构设计miR-145反转录及实时定量PCR引物进行扩增，观察其在组织中的表达情况。该方法具有简便、灵敏及快速的优点，miR-145在54例标本中表达显著低于其在正常组织中的表达，与龚文容等［7］在结直肠癌中观察到的miR-145表达情况一致。

miR-145在多种肿瘤中呈低表达，但是不同肿瘤或相同肿瘤不同学者的研究发现，miR-145与临床病理参数的相关性存在差异。师婕和张林燕［8］采用实时定量PCR检测宫颈鳞癌miR-145的表达情况，发现Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期以及在宫颈鳞癌高、中分化与低分化组中miR-145的差异无统计学意义（P＞0.05）。褚以忞等［9］的研究发现miR-145与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤浸润深度以及淋巴结转移均无显著性相关。然而，在本研究中miR-145与胃癌患者组织学分级以及淋巴结转移间具有显著相关性（P＜0.05），这可能与胃癌患者的选择、数量有关，也与实时定量PCR中引物的设计、内参的选择、扩增的条件等因素密切关系。

综上所述，本研究初步证实了miR-145在胃癌患者中表达呈下调，可能与胃癌的发生、发展具有密切关系，为胃癌细胞进行miR-145的相关功能学研究及可能的信号调控通路研究提供了一定的基础，为胃癌靶向治疗提供了新的靶点。

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［2］Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines Cancer gene targets［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（7）：2257-2261.

［3］Sachdeva M，Zhu S，Wu F，et al.P53represses c-Myc through induction of the tumor suppressor miR-145［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（9）：3207-3212.

［4］Kent OA，Chivukula RR，Mullendore M，et al.Repression of the miR-143／145cluster by oncogenic Ras initiates a tumor-promoting feed-forward pathway［J］.Genes Dev，2010，24（24）：2754-2759.

［5］张睛，吴正升，张瑰红，等.Mir-145在乳腺癌中表达及意义［J］.临床与实验病理学杂志，2009，25（1）：9-12.

［6］Schepeler T，Reinert JT，Ostenfeld MS，et al.Diagnostic and prognostic microRNAs in stageⅡcolon Cancer［J］.Cancer Res，2008，68（15）：6416-6424.

［7］龚文容，卢晓明，陈志松，等.miR-145在结直肠癌组织的表达及临床意义［J］.中华实验外科杂志，2011，28（1）：35-36.

［8］师婕，张林燕.宫颈鳞癌患者组织中miR-145的表达及意义［J］.疑难病杂志，2013，12（5）：359-361.

［9］褚以忞，彭海霞，李吉，等.miR-145在胃黏膜癌变中的表达及其意义［J］.胃肠病学，2013，18（1）：45-47.