封闭式负压吸引治疗中不同负压模式对疗效影响实验研究＊

西安市中心医院烧伤整形外科 （西安710003） 郝 剑 刘 宾 汪 阳 陶 谏 田 萍

负压 创 面 治 疗 技 术 （Negative pressure wound therapy，NPWT）是一种促进创面愈合的医疗技术。该技术是将吸引装置与特殊的伤口敷料连接后，使伤口保持在负压状态，可以改善创面微循环，促进创面肉芽生长，减少细菌定植和繁殖，保持伤口环境湿润，从而达到治疗创面的目的。封闭式负压吸引技术可分为持续性负压吸引、间断式负压吸引以及变压式负压吸引，而目前临床上对于应用该技术治疗慢性创面时负压模式的选择没有一个统一的规范与标准。我们通过初步的实验，探索应用封闭式负压引流技术治疗慢性创面时的较为合理的负压治疗模式，为该技术在临床创面治疗领域更广泛的应用打下良好的理论基础。

材料与方法

1 材 料 封闭式负压吸引装置及敷料（武汉维斯第公司）。构建兔耳慢性创面模型：健康CL级新西兰大耳白兔24只，48～60月龄（老龄兔），体重3．9～5．0kg。30g／L戊巴比妥钠1．5ml／kg耳缘静脉麻醉，多普勒血流仪测定兔耳背侧动静脉走向及分布，从根部向远端分段结扎兔耳中央动脉及头侧动静脉，结扎后血管呈紫黑色，在耳根部切开皮肤，切断中央动脉及头侧动静脉，保留尾侧静脉及周围皮肤约0．5cm，将软骨膜掀开并向两侧分离约0．5cm，去除游离的软骨膜，缝合皮肤。用手术刀在耳腹侧制5cm×2cm的长方形创面，刮除软骨膜，暴露软骨。以明胶海棉薄片蘸取0．9%生理盐水覆于每个创面 外层覆盖无菌密封薄膜。为维持缺血状态，于术后3d、6d、9d和12d在兔耳根部多次行环扎手术，直至软骨表面形成稳定创面。

2 方 法

2．1 分组：将入选兔耳慢性创面模型随机分为三组，每组8只16例创面，第一组为持续性负压吸引组，第二组为间断性负压吸引组，第三组为变压性负压吸引组。创面及创周用生理盐水和氯己定（1∶1000）清洗后，按创面大小修剪多孔藻酸盐敷料，置入创面至创缘，引流管由创缘直接引出，透明贴膜封闭整个创面。将引流管通过连接管连于负压终端，持续负压吸引组负压参数120mmHg，间断负压吸引组负压参数为0mmHg及120mmHg，变压负压吸引组负压参数为10～120mmHg。在三种压力治疗模式下分别对兔耳慢性创面进负压吸引治疗。

2．2 创面大体观察：将上述三治疗组分别于负压下处理24、48、72h后更换创面藻酸盐敷料，观察创面的渗出、异味以及肉芽组织生长情况。在治疗前及每个治疗时间点分别于创缘切取2mm×2mm×2mm大小的组织块及创缘正常皮肤行后续组织学检查。

2．3 创面收缩测量：分别于负压持续处理24、48、72h测量各组创面的长度及宽度，计算创面收缩率［1］。

2．4 细胞周期测定：活检组织生理盐水清洗后，置于5ml Dispase液中，37℃，2h。分离表皮（刮除方法），加入0．1g／L的胰蛋白酶5ml，吹打3～5min，取上清。200目滤网过滤，取滤液，加入50ml／L小牛血清离心（1000r／min，10min）。弃上清，加入 DMEM 5ml，轻轻吹打后同法离心2次，去除小碎片。弃上清，加入PBS 1ml，轻轻吹打，调整细胞数至（1～2）×106。将细胞悬液加入2ml 4%酒精中固定，封口，4℃保存。固定的细胞悬液用PBS离心洗涤2次，调整细胞数至1×106，加入PI染液1ml，4℃冰箱避光染色30min，流式细胞仪测定分析细胞周期。

2．5 免疫组化SABC法检测细胞核增殖抗原（PCNA）：参照Boster公司产品使用说明操作。15μm石蜡切片，二甲苯脱蜡，甲醇－30ml／L 过氧化氢，30min，PBS 清 洗 5min×3 次，50ml／L 兔 抗 血 清30min，PCNA单抗（1∶200）室温过夜，PBS清洗5min×3次，羊抗兔血清（1∶200），室温30min，SABC室温下30min。PBS清洗5min×3次，DAB显色，脱水、透明，封片，观察。以0．01mol／L的PBS代替一抗作阴性对照。结果判断：400倍光镜下观察记录5个视野内平均阳性细胞数。阳性细胞数低于5个计为（－），5～10个计为（＋），10个以上计为（⧺），大于半数计为（⧻）。

2．6 统计学方法：采用SPSS11．0统计学软件，组织学及免疫组化结果按等级资料分析；细胞周期测定值作成组t检验，方差不齐时作t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 创面大体观察结果 24h：持续负压组、间断负压及变压负压三组均引流通畅、创面分泌物减少、创面出现收缩；48h：三组均引流通畅，创面分泌物减少，持续负压组创面缩小无明显变化，间断及变压两组创面持续缩小；72h：三组均引流通畅、其中变压治疗组肉芽组织鲜红并均匀扩大；持续负压吸引组肉芽组织散在，分布不均匀，间断负压治疗组肉芽组织生长情况介于二者之间。

2 创面收缩率 经过负压吸引治疗的各组创面均出现明显收缩，其中持续负压吸引组创面持续收缩72h，但创面面积缩小不明显。间断负压吸引组和变压负压吸引组负压治疗开始后也出现明显创面收缩，且随治疗时间延长创面面积出现逐渐缩小（附图）。

3 细胞周期测定 正常皮肤组织细胞以G0／G1期为主，S期及G2＋M期细胞比例较小。治疗后24h及48h，持续负压吸引组S期及G2＋M期细胞均与创缘正常皮肤基本相同，统计学分析无显著性差异（P＞0．05）；治疗48h间断负压及变压负压吸引组S期及G2＋M期细胞出现增多（P＜0．05）；治疗后72h，三组S期及G2＋M期细胞均较正常皮肤组明显增多 （P＜0．05）。这表明：负压治疗的早期（24h之内）创面未出现明显的上皮细胞增生；间断负压和变压治疗较持续负压能够更早的诱导组织细胞增生，见表1。

附图 三种负压模式不同治疗时间创面面积收缩率

表1 正常皮肤与不同负压模式处理组创面细胞周期变化（±s）

表1 正常皮肤与不同负压模式处理组创面细胞周期变化（±s）

24h 48h 72h细胞周期 正常皮肤80．23±8．34 77．41±8．47 76．27±7．89 S 7．58±3．58 8．08±3．43 8．12±3．28 7．41±3．26 7．62±3．48 14．18±4．27 15．67±5．19 15．31±4．79 16．97±5．14 17．36±5．09 G2＋M 1．24±1．16 1．91±1．12 1．90±1．09 1．37±1．03 1．95±1．04 4．59±2．36 4．86±2．29持续负压 间断负压 变压负压G0／G191．18±8．03 90．01±8．24 89．98±8．17 91．22±8．35 90．43±8．37 81．23±7．65 79．47±8．54持续负压 间断负压 变压负压 持续负压 间断负压 变压负压4．46±1．99 5．52±2．18 6．37±1．96

治疗24h三组S期及G2＋M期细胞与正常皮肤组比较无显著差异（P＞0．05）；治疗48h间断负压，变压负压两组S期及G2＋M期细胞与正常皮肤组比较，有显著性差异（P＜0．05）；持续负压组S期及G2＋M期细胞与正常皮肤组比较，无显著性差异（P＞0．05）；治疗72h三组S期及G2＋M期细胞与正常皮肤组比较，有显著性差异（P＜0．05）。

4 PCNA表达改变 正常皮肤组织中细胞核增殖抗原（PCNA）表达阳性细胞主要是皮肤基底细胞，表皮细胞、成纤维细胞及毛囊上皮细胞PCNA均为阴性。治疗24h，持续负压、间断负压及变压负压三组创面组织中皮肤基底细胞，表皮细胞、成纤维细胞及毛囊上皮细胞PCNA均为阴性，表明在负压治疗的早期（24h内），创面没有出现明显的组织细胞增殖；治疗48h，变压负压及间断负压治疗组，成纤维细胞及毛囊上皮细胞PCNA出现阳性，持续负压组为阴性；治疗72h，变压负压及间断负压治疗组，成纤维细胞及毛囊上皮细胞PCNA表达明显增强，而成纤维细胞更为明显；持续负压治疗组三种细胞PCNA表达均出现阳性，此结果提示间断负压及变压负压治疗可能较早的诱发创面组织细胞的增殖，见表2。

治疗24h：三负压处理组中三类细胞PCNA表达水平与正常皮肤组比较，无显著性差异（P＞0．05）；治疗48h：间断负压与变压负压中成纤维与毛囊细胞PCNA表达水平与正常皮肤组比较，有显著性差异（P＜0．05）；治疗72h：持续负压、间断负压、变压负压三组中成纤维与毛囊细胞PCNA表达水平与正常皮肤组比较，有显著性差异（P＜0．05）。

表2 正常皮肤与不同负压处理组创面PCNA表达水平（±s）

表2 正常皮肤与不同负压处理组创面PCNA表达水平（±s）

24h 48h 72h分组 正常皮肤持续负压 间断负压 变压负压基底细胞 ＋～⧺ ／ ／ ／ ／ ／ －～＋ －～＋ －～＋ －～＋持续负压 间断负压 变压负压 持续负压 间断负压 变压负压成纤维细胞 — — — — — ＋～⧺ ＋～⧺ －＋～⧺ ⧺～⧻ ⧺～⧻毛囊上皮细胞 — — — — — ＋ ＋ ＋～⧺ ＋～⧺ ＋～⧺

讨 论

作为近几年来兴起的一种促进创面愈合的技术，封闭式负压吸引为慢性创面的处理及治疗提供了一种良好的选择［2，3］。封闭式负压吸引技术为创面肉芽组织生长提供了一个相对封闭、潮湿及无菌的环境，它可促进创面的血液微循环及肉芽组织生长，降低换药所带来的创面疼痛。国内外学者将负压创面治疗技术应用于多种急、慢性创面的治疗或促进移植皮肤、皮瓣的成活，均取得了良好的效果［4］。

目前，临床上负压吸引治疗所用的压力模式多为持续性恒定压力，这种治疗模式的优点是简单方便、易于推广，在有中心负压病房的临床科室很容易开展。然而欧美负压创伤治疗学会的基础理论研究显示，在一定范围的负压下，间断压力或者变化压力的吸引方法，更加符合创面修复的病理循环周期，有利于细胞的有丝分裂和蛋白合成以及各种组织再生和肉芽生长，加速创伤愈合过程［5］。因此我们将三种负压模式作用于兔耳慢性创面模型，通过对各种压力模式下不同时间创面大体外观、收缩率、细胞周期及细胞核增殖抗原表达的测定与分析，探讨间断性负压以及变压性负压这两种不同负压治疗模式在临床应用的可行性。

通过对三种负压模式处理后创面外观的观察发现：三种压力模式在72h左右均可以达到诱导肉芽组织生长、通畅引流及促进创面收缩的治疗效果。而间断负压以及变压负压在促进肉芽组织生长及创面收缩方面的效果更加明显。持续负压吸引可以立即诱发创面的收缩，且在整个治疗的过程保持不变。间断负压以及变压负压在治疗的开始也立刻出现创面的收缩，但与持续负压吸引不同的是，这种收缩是逐渐增加的，也就是说，伤口面积在逐渐减。因此在治疗72h后，我们可以发现间断负压及变压负压组的创面面积明显较持续负压组变小。这种差异的可能原因是由于间断负压及变压负压的按摩效果，刺激创面边缘组织的细胞骨架重构、导致信号Cascade及生长因子释放，促进细胞的有丝分裂以及组织生长［6，7］。

通过应用流式细胞仪测定各组样本组织细胞DNA含量，计算出各期细胞所占比例，发现三种负压模式处理创面在24hS期及G2＋M期细胞较正常皮肤均未明显增多；48h间断及变压负压治疗组S期及G2＋M期细胞出现增多；72h三组创面S期及G2＋M期细胞均明显增多；提示组织细胞增殖活跃，创面进入修复状态在传统的持续性负压吸引治疗中开始于治疗后72h而通过改变负压吸引模式为间断性或变压性，则有能将这一修复开始时间提前至治疗开始后48h。

正常情况下，PCNA存在于部分皮肤基底细胞核内，如出现在成纤维细胞或其他细胞内，则表示组织细胞增殖活跃。本实验发现，在治疗后72h三种负压治疗模式中创面组织中皮肤毛囊上皮细胞及成纤维细胞PCNA均呈现高表达，均与对照组创缘周围正常皮肤有显著差异。治疗48h间断负压及变压负压治疗组创面组织中皮肤毛囊上皮细胞及成纤维细胞PCNA均呈现阳性表达，与对照组创缘周围正常皮肤有显著差异，而持续负压吸引组则为弱阳性表达。在治疗开始的24h三组创面PCNA均呈阴性。这一结果也与创面细胞周期实验结论相符。

封闭式负压吸引治疗可改善创面的血液微循环并促进创面肉芽组织生长。相对传统的持续负压，间断负压及变压负压这两种负压吸引模式，能够较早的诱导创面细胞增殖，促进肉芽组织生长及伤口收缩。因此，在封闭式负压吸引技术治疗慢性创面时，间断负压和变压负压这两种模式可以作为治疗中的优先选择。

［1］ Borgquist O，Ingemansson R，Malmsjo M．Micro－and macromechanical effects on the wound bed by negative pressure wound therapy using gauze and foam［J］．Ann Plast Surg，2010，64（6）：789－93．

［2］ Armstrong DG，Lavery LA．Negative pressure wound therapy after partial diabetic foot amputation：a multicentre，randomised controlled trial［J］．Lancet，2005，366：1704－1710．

［3］ Lavery LA，Boulton AJ，Niezgoda JA，et al．A comparison of diabetic foot ulcer outcomes using negative pressure wound therapy versus historical standard of care［J］．Int Wound J，2007，4：103－113．

［4］ Saraiya HA，Shah N．Use of indigenously made negativepressure wound therapy system for patients with diabetic foot［J］．Adv Skin Wound Care，2013，26（2）：74－7．

［5］ Borgquist O，Ingemansson R，Malmsjo M．The effect of intermittent and variable negative pressure wound therapy on wound edge microvascular blood flow［J］．Ostomy Wound Manage，2010，56（3）：60－7．

［6］ Borgquist O，Ingemansson R，Malmso M．Micro－and macromechanical effects on the wound bed by negative pressure wound therapy using gauze and foam［J］．Ann Plast Surg，2010，64（6）：789－93．

［7］ Saxena V，Hwang CW，Huang S，et al．Vacuum－assisted closure：microdeformations of wounds and cell proliferation［J］．Plast Reconstr Surg，2004，114（5）：1086－96．