外源硅酸钠对砂糖橘抗寒性的影响

范七君+牛英+刘萍+刘冰浩+娄兵海+陈国平+冷付春+覃旭

摘要：以一年生砂糖橘（Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju）为材料，以喷施去离子水为对照，比较了喷施0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L不同浓度外源硅酸钠（Na2SiO3）溶液处理后，砂糖橘叶片在4 ℃低温条件下的生理变化。结果表明，与对照相比，在4 ℃低温胁迫下，Na2SiO3预处理的砂糖橘叶片叶绿素含量增加，SOD、POD等抗氧化酶活性升高，相对电导率降低。说明外源Na2SiO3能提高砂糖橘的抗寒性，其中以0.1 mmol/L的Na2SiO3溶剂处理的效果最好。

关键词：砂糖橘（Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju）;抗寒性;硅酸钠

中图分类号：S666.2;S426;S143.7+9      文献标识码：A      文章编号：0439-8114（2014）20-4874-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.027

Effects of Exogenous Sodium Silicate on Cold Tolerance

of Citrus reticulata cv. Shatangju

FAN Qi-jun1，NIU Ying1，LIU Ping1，LIU Bing-hao1，LOU Bing-hai1，CHEN Guo-ping2，

LENG Fu-chun1，QIN Xu1

（1. Guangxi Citrus Biology Key Laboratory，Guangxi Academy of Specialty Crops， Guilin 541004， Guangxi， China;

2. Guangxi Agriculture Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530022， China）

Abstract： To elucidate the roles of Sodium silicate （Na2SiO3） in enhancing tolerance of cold stress （4 ℃） in Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju， one-year old nursery cultured C. reticulata cv. Shatangju was used to investigate the physiological changes of plants exposing to 4 ℃ low temperature stress after pretreated with different Na2SiO3 concentration of 0 mmol/L， 0.1 mmol/L， 1.0 mmol/L， 10.0 mmol/L and 20.0 mmol/L. The results showed that comparing with the control plants （0 mmol/L Na2SiO3） ， the Na2SiO3 pretreated plants had more chlorophyll and higher antioxidant activities of enzymes including SOD， POD. Relative conductivity was reduced. It is indicated that exogenous Na2SiO3 enhanced the cold tolerance of low temperature stress in C. reticulata cv. Shatangju. The 0.1 mmol/L pretreatment had the best effects.

Key words： Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju; cold tolerance; Sodium silicate

中国大部分地区的农作物在其生长周期内都会遭受低温天气的伤害，尤其是在南方地区，虽然南方冬季的绝对温度不低，但是许多热带、亚热带作物忍受低温的能力较差，当冬天的气温在0 ℃以上时也时常遭受低温伤害，这种低温伤害对作物的产量及品质会造成一定的影响。砂糖橘（Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju）是广西壮族自治区主栽的优良柑橘品种之一，但是砂糖橘也不耐低温，冬季经常遭受低温伤害。

硅（Silicon，Si）是地壳中含量丰富的元素。虽然目前尚无足够的证据证明硅是植物生长的必需元素，但是越来越多的研究表明，硅对禾本科（Gramineae）等植物的健康生长是有益的[1]。近年研究表明，硅能提高植物对盐害、干旱及重金属胁迫等的抗逆性[2-4]。关于硅对植物抗寒性影响的研究报道相对较少，仅在小麦（Triticum aestivum L.）[5]、黄瓜（Cucumis sativus L.）[6]等作物上有相关报道;研究表明，施硅能提高低温胁迫条件下小麦幼苗的净光合速率（Net photosynthetic rate）、气孔导度（Stomatal conductance）、水分利用率（Water use efficiency），减缓低温胁迫对叶绿素（Chlorophyll）含量和可溶性糖（Soluble sugar）含量的影响;加硅处理能使低温胁迫下的黄瓜幼苗超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性显著升高，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物阴离子自由基（Superoxide anion radical，■）下降，可减少低温胁迫对黄瓜幼苗的伤害。然而对于硅提高植物抗寒性的机理还不是十分清楚。为此，试验以广西壮族自治区主栽柑橘品种砂糖橘为材料，从生理生化方面比较外源硅酸钠（Na2SiO3）对低温胁迫下砂糖橘抗寒性的影响，以期为阐明硅提高植物抗寒性的机理提供参考，并为砂糖橘田间施用硅肥、以减少低温伤害提供技术支持。

1  材料与方法

1.1  试验设计

以一年生枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]砧砂糖橘为材料，用Na2SiO3为外源硅;砂糖橘定植于黑色塑料营养袋中，每袋种植1株。每个处理4袋（株）， Na2SiO3溶液浓度分别为0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L，4个Na2SiO3处理加1个对照处理共计20株苗。每天在每株叶面和根等部位分别喷施50 mL Na2SiO3溶液;对照每天在每株叶面和根等部位喷施50 mL去离子水。14 d后，在智能人工气候箱中4 ℃低温处理24 h，分别于0、1、6、12、24 h在相同部位取叶样。样品一部分即时用于电导率和叶绿素含量的测定，另一部分置于液氮中保存，用于抗氧化酶活性的测定。

1.2  测定方法

1.2.1  相对电导率（Relative conductivity，REC）测定相对电导率测定参考文献[7]的方法，略作修改。取0.1 g叶片，去离子水冲洗3次，避开叶脉剪碎，加入5 mL去离子水，400 r/min振荡2 h后，测定电导率值C1，而后100 ℃沸水煮沸10 min，冷却至室温后再测定电导率值C2，按下式计算求得REC，

REC=C1/C2×100%。

1.2.2  叶绿素含量测定  叶绿素含量测定参考文献[7]的方法，略有改动。取0.1 g（FW） 叶片在1 mL 80 %（V/V）的丙酮中研磨成匀浆，并在黑暗中静置15 min。然后将上述粗提液于室温下10 000 r/min离心20 min，所得上清液0.5 mL（V）在Cary50UV-Vis分光光度计上分别于663、645和480 nm 处比色，分别读取OD值A1、A2、A3。叶绿素含量分别按下式计算：

叶绿素a（Ca）含量：Ca=12.72×A1-2.59×A2;

叶绿素b（Cb）含量：Cb=12.72×A2-2.59×A1;

总叶绿素[C（a+b）]含量：C（a+b）=20.29×A2-8.05×A1;

样品中叶绿素含量=C（a+b）×V/FW。

式中，V为叶绿素总的提取液体积（mL），FW为样品鲜重（g）。

1.2.3  抗氧化酶活性测定  ① 酶液的提取。称取样品0.5 g，加入2 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8），于研钵（冰浴）中研磨成匀浆，用磷酸缓冲液定容到5 mL，然后在4 ℃、10 000 r/min高速冷冻离心机中离心20 min，上清液即为待测酶液。② 蛋白测定。样品蛋白含量测定参考文献[8]的方法，上述酶液用考马斯亮蓝染色后于Cary 50 UV-Vis分光光度计上在595 nm处读取OD值，用标准曲线计算蛋白含量。③ SOD活性测定。SOD活性测定采用NBT法，参考文献[9]的方法，略有改动。在3 mL的酶反应体系中含有1.5 mL 0.05 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0）、0.3 mL 130 mmol/L的蛋氨酸溶液、0.3 mL 750 μmol/L的NBT溶液、0.3 mL 100 μmol/L的EDTA-Na2溶液、50 μL的待测酶液、0.25 mL的去离子水、0.3 mL 0.05 mol/L的核黄素溶液（pH 7.0）。依次加入以上成分后，在温度为25 ℃、光照为4 000 Lx条件下静置20 min，以磷酸缓冲液代替酶液作为对照，对照设置光对照和暗对照各1个，光对照同样品一起在光照下静置20 min，暗对照在黑暗中静置20 min。把暗对照调零，测定在560 nm处的OD值，计算出不同酶液量在反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率，以出现50%抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活单位（U）。按下式计算SOD活性：

SOD活性[U/g（protein）]=（AL-AS）×VT/（0.5× AL×VS×W）。

式中，AL为光对照的OD值，AS为样品的OD值，VT为提取酶液总体积（mL），VS为测定时所用酶液的体积（mL），W为样品的蛋白质量（g）。④ POD活性测定。POD活性的测定采用愈创木酚法，参考文献[9]的方法。在3 mL的酶反应体系中含有1 mL的 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）、1 mL的3‰（V/V）的H2O2、0.95 mL的2‰（V/V）的愈创木酚液、50 μL酶液。反应体系最后加入酶液启动反应，在470 nm处测定OD值。以每分钟内OD470变化0.01为一个POD活性单位，按下式计算POD活性：

POD活性[U/g（protein）]=（△OD470×VT）/（0.01× W×VS×t）。

式中，△OD470为反应时间内吸光度的变化，VT为提取酶液的总体积（mL），W为样品的蛋白质量（g），VS为测定时所用酶液的体积（mL），t为反应时间（min）。

1.3  数据分析

试验所得数据采用Microsft Office Excel 2000软件进行处理，再用SAS统计分析软件对试验数据比较差异显著性。

2  结果与分析

2.1 喷施外源Na2SiO3对砂糖橘叶片相对电导率的影响

喷施外源Na2SiO3对砂糖橘叶片相对电导率的影响情况见图1。由图1可知，在4 ℃的低温胁迫过程中，Na2SiO3处理的叶片其相对电导率均低于对照的相对电导率;在胁迫24 h时，对照的相对电导率达到了32.33%，而0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L处理的相对电导率分别为25.25%、26.27%、27.39%、28.23%，说明喷施外源Na2SiO3均可以提高砂糖橘叶片的抗寒性。其中又以0.1 mmol/L处理的提高抗寒性效果最好。其相对电导率比对照低21.9%，与对照存在极显著差异水平（P<0.01）。

2.2  喷施外源Na2SiO3对砂糖橘叶片叶绿素含量的影响

喷施外源Na2SiO3对砂糖橘叶片叶绿素含量的影响情况见图2。由图2可知，在4 ℃低温胁迫前（0 h），Na2SiO3处理的叶绿素含量与对照的叶绿素含量没有差异;而在低温胁迫24 h时，对照的叶绿素含量为79.46 μg/g，而0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L处理的叶绿素含量分别为129.28、109.35、103.75、92.31 μg/g，，说明喷施外源Na2SiO3均可以提高砂糖橘叶片的叶绿素含量，其中又以0.1 mmol/L处理的效果最好，其叶绿素含量比对照增加了62.7 %，与对照存在极显著差异（P<0.01）。

2.3  喷施外源Na2SiO3对砂糖橘叶片SOD活性的影响

喷施外源Na2SiO3对砂糖橘叶片SOD活性的影响情况见图3。由图3可知，在4 ℃低温胁迫24 h时，对照的SOD活性为99.09 [U/g（protein）]，而0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L处理的SOD活性分别为124.08、114.16、112.28、106.12 [U/g（protein）]，说明喷施外源Na2SiO3均可以提高砂糖橘叶片的SOD活性，其中又以0.1 mmol/L Na2SiO3处理的SOD活性增幅最大，比对照增加了25.2%，与对照存在极显著差异（P<0.01）。

2.4  喷施外源Na2SiO3对砂糖橘叶片POD活性的影响

喷施外源Na2SiO3对砂糖橘叶片POD活性的影响情况见图4。由图4可知，在胁迫24 h时，对照的POD活性为3 380 [U/g（protein）]，而0.1、1.0、10.0、20.0 mmol/L处理的POD活性分别为4 652、4 072、3 816、3 580 [U/g（protein）]，说明喷施外源Na2SiO3均可以提高砂糖橘叶片的POD活性，其中又以0.1 mmol/L Na2SiO3处理的POD活性增加最多，比对照增加了37.6 %，与对照存在极显著差异（P<0.01）。

3  讨论

硅肥作为一种新型肥料不仅能够提高作物的产量，还能改善作物的品质，提高作物的抗逆性，已被国际植物营养学界认为是继氮、磷、钾之后第四大植物营养元素[10，11]。硅肥在农业发达国家已得到广泛应用，中国于20世纪70年代从日本引入，目前在我国发达地区应用较多。因此试验考察硅肥（硅酸钠）对砂糖橘叶片抗寒生理的影响，旨在研究硅肥提高砂糖橘抗寒性的可能机理，进一步为生产上施用硅肥提供一定的技术支撑。

近年来，硅在提高植物对盐害、干旱、重金属胁迫等抗逆性方面的研究较多[12，13]，然而关于硅对柑橘抗寒性的报道较少。试验对外源硅（硅酸钠）能否提高砂糖橘的抗寒性作了初步探讨，结果显示，在4℃的低温胁迫下，施硅处理的砂糖橘叶片细胞受到的伤害较轻，因而细胞电解质外渗少，相对电导率较小，说明外源硅可以提高砂糖橘叶片的抗寒性。

光合作用是植物生长发育的基础生命活动之一，叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是绿色叶片进行光合作用时捕获光能的重要物质，其含量的高低在某种程度上与光合作用的强弱呈正相关[14];但是低温使叶绿素的合成受到抑制，叶绿素含量明显下降。在低温胁迫下，砂糖橘叶片中的叶绿素含量逐渐降低;然而施硅可以缓解低温胁迫下叶绿素含量下降的幅度，使植株在低温条件下维持相对较高的光合速率，从而保障基本的生命活动，增强了对低温胁迫的抵抗能力。

活性氧（Reactive oxygen species）带来的氧化伤害是低温等非生物胁迫中的主要伤害之一。在非生物胁迫下，植物体内产生超氧阴离子等自由基，这将对细胞膜等产生氧化伤害，超氧化物歧化酶可以把超氧阴离子（O2-）分解为氧分子和过氧化氢（H2O2），过氧化物酶则可以把过氧化氢分解为无毒的水和氧分子，因此超氧化物歧化酶和过氧化物酶在抗氧化酶系统中具有很重要的作用[14]。试验结果显示，低温胁迫下砂糖橘叶片中超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性先是逐渐增加然后减少，施硅处理的超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性比不施硅处理的高，从而使植株在低温条件下可免受过多的氧化损伤，维持细胞器等的正常功能，增强了对低温胁迫的抵抗能力。

综上所述，在低温胁迫下，加硅（硅酸钠）处理可以减缓砂糖橘叶片叶绿素的降解，维持相对较强的光合作用，保证砂糖橘基本新陈代谢的能量需求;同时可以提高超氧化物歧化酶、过氧化物酶等抗氧化酶的活性，缓解活性氧对细胞膜等造成的氧化伤害，使砂糖橘在低温胁迫下保持较正常的细胞机能。虽然外源硅（硅酸钠）处理通过增强光合作用和提高抗氧化能力，提升了砂糖橘对低温胁迫的抵抗能力。但是外源硅提高砂糖橘抗寒性的机制比较复杂，还有待后续进一步深入研究来不断完善。

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