Genistein对Aβ所致痴呆大鼠工作记忆的影响及机制探讨

原 丽 郭小姝 解 瑞 刘晓杰 李清山 刘 燕 张翠英

1.山西长治医学院生理教研室，山西长治 046000；2.长治医学院附属和平医院眼科，山西长治 046000

来源于大豆的异黄酮类物质染料木黄酮（Genistein）又称金雀异黄素，其结构特与相对分子量均与17β-雌二醇（E2）的结构相似，与雌激素受体β 具有较高的亲和力，被称为植物雌激素[1]。因而被认为低剂量的Genistein 可能是雌激素替代治疗或预防神经退行性疾病的有效措施。体外研究也发现，低剂量Genistein 可通过激活Akt 诱导Nrf2 活性，从而降低淀粉样肽诱导的神经元降解，改善Aβ1-40 所致的痴呆模型大鼠的空间学习记忆的损伤[2]。高剂量的Genistein 可以产生神经元细胞毒作用，并导致细胞凋亡[3]；但不同浓度Genistein 对痴呆模型大鼠工作记忆的具体影响如何及其可能的机制还未见报道。β 淀粉样肽( β-amyloid peptides，Aβ)在脑内沉积是阿尔茨海默病（Alzheimer＇s disease，AD）发生发展的重要病理基础，最终患者出现进行性的学习记忆和认知功能障碍[4]。故该实验通过侧脑室注射Aβ1-40 制备AD 模型大鼠，观察不同剂量的Genistein 对AD 模型大鼠空间学习记忆和工作记忆的影响，并探讨其可能的机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及给药

3月龄的健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(230±30)g50 只，由山西医科大学动物中心提供。Genistein 和Aβ1-40 试剂均购于美国Sigma 公司产品，Aβ1-40 溶于0.9%的生理盐水，Genistein溶于0.5%二甲基亚砜(DMSO)，SD 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg)后，固定暴露颅骨，参照脑立体定位图谱，侧脑室给药；Genistein 灌胃1 次/d，坚持4 周。

1.2 实验分组

随机将SD 大鼠分为5 组：0.9%生理盐水组、0.5% DMSO 溶剂组、25 nmol Aβ1-40 组、2.0 mg/kg Genistein+Aβ1-40 组、20 mg/kg Genistein+Aβ1-40。

1.3 Y 迷宫测试

Y 迷宫由3 个等长互为120°角的臂组成,随机定为A、B、C 区。实验时将大鼠放入1 个臂的末端,让其自由出入3 个臂,记录持续8 min，并记录大鼠进入各区的次序和总次数（N），以连续进入3 个不同的臂为1 次正确交替反应,记录正确交替反应次数。自发交替反应率(%)=[正确交替反应次数/(N-2)]×100。

1.4 实时荧光定量PCR

行为学实验结束后，5 组大鼠断头处死、取脑，并分离出海马组织进行超声匀浆、提取总RNA、逆转录为cDNA、然后采用Real time PCR 以GAPDH 为内参检测海马组织中STAT3 和Caspase-3 的mRNA 相对表达量。引物设计具体见表1。

表1 PCR 实验引物设计

1.5 统计方法

统计学分析采用SPSS18.0 软件进行，所有数据用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析的Tukey HSD 法进行检验。

2 结果

2.1 各组大鼠短期工作记忆能力的比较

该研究的实验结果显示（表2），各组大鼠在8 min 的自发交替试验中进入Y 迷宫3 个臂的总次数之间差异无统计学意义（P>0.01），表明药物的给予并没有影响动物的自发活动。但与正常对照组相比较，Aβ1-40 组大鼠自发交替反应率明显降低（P=0.000 1），0.5%DMSO 溶剂组与对照组差异无统计学意义(P>0.01)；与Aβ1-40 组相比，Genistein 低剂量组（2 mg/kg）大鼠的自发交替反应率显著增加（P=0.000），高剂量组（20 mg/kg）大鼠的自发交替反应率差异无统计学意义（P>0.01）。

表2 各组大鼠Y 迷宫自发交替实验[n=10，（±s）]

表2 各组大鼠Y 迷宫自发交替实验[n=10，（±s）]

注：各组与正常对照组相比，**P<0.01;各组与Aβ1-40 相比，##P<0.01。

组别进臂总次数自发交替反应率(%)P 值（与对照组比较）对照组0.5%DMSO 组25 nmol Aβ1-40 组2.0 mg/kg Genistein+Aβ1-40 组20.0 mg/kg Genistein+Aβ1-40 组28.50±3.10 26.70±3.95 86.08±3.45 84.40±2.87-0.789 27.90±4.04（68.96±6.17）**0.000 27.45±3.64 25.89±3.24（85.53±6.83）##67.55±4.78 0.981 0.000 P 值（Aβ1-40 组比较）---0.000 0.780

2.2 各组大鼠海马组织STAT3 和Caspase-3 mRNA 相对表达量的比较

如图1A所示，正常对照组中，STAT3 和Caspase-3 的mRNA相对表达量分别是（0.99±0.03）和（1.0±0.02）,0.5%DMSO 组则分别是（0.97±0.05）与（1.01±0.06），两组之间差异无统计学意义（P>0.01），但与对照组相比，Aβ1-40 组STAT3 mRNA 相对表达量显著下降（0.79±0.04，P<0.01），Caspase-3 的mRNA 相对表达量却明显升高（1.25±0.06）；图1B 显示，给予低剂量Genistein(2 mg/kg)长期处理后，与Aβ1-40 组相比较，STAT3mRNA 的相对表达量升至（0.96±0.03）（P<0.01），Caspase-3 的mRNA 相对表达量降至（1.0±0.05）(P<0.01)，高剂量Genistein(20 mg/kg)长期处理并无显著改善，STAT3 和Caspase-3 mRNA 的相对表达量分别是（0.70±0.02）和（1.28±0.05）（P>0.01）。

图1 各组大鼠海马组织STAT3 和Caspase-3mRNA 相对表达量A：0.5%DMSO 溶剂组和25nmol Aβ1-40 组与对照组中mRNA 相对表达量的比较，**P<0.01 vs 对照组；B：不同剂量Genistein 治疗组与Aβ1-40 组中STAT3 和Caspase-3 的mRNA 相对表达量比较，##P<0.01 vs Aβ1-40 组。

3 讨论

Genistein 是异黄酮类物质中活性最高的一种，与E2R 结合后表现出雌激素样作用，但同时也具有抗雌激素样作用[5]。而该研究结果显示，长期低剂量Genistein 灌胃后可拮抗Aβ1-40 所产生的神经毒作用，但高剂量的Genistein 并没有改善Aβ1-40所导致大鼠海马认知功能障碍。Maryam 等[6]的研究表明Genistein预处理后可以改善Aβ1-40 所诱导大鼠短期的空间辨别记忆障碍。这与该实验结果非常相似，我们的Y-迷宫自发交替实验结果提示，长期低剂量的Genistein 治疗后可以拮抗Aβ1-40 的神经毒作用，逆转大鼠工作记忆的损伤，这是对Maryam 等研究的完善与补充，同时该研究还发现，高剂量的Genistein 处理后，与Aβ1-40 组相比较，自发交替实验百分率并没有改善，提示，高剂量的Genistein 并不能发挥神经保护效应。体外实验发现[7-8]，高剂量的Genistein 可以促发原代培养的皮层神经元的凋亡和坏死，从而影响神经元的功能，Choi[3]的在体实验也表明，雄性SD 大鼠长期摄取高剂量的Genistein 后，脑组织匀浆中乳酸脱氢酶含量明显升高，诱发细胞毒作用。有报道称低剂量的Genistein 可以发挥雌激素受体β 激动剂效应，拮抗Aβ 诱导的神经元细胞的死亡，但高浓度的Genistein 可以作为蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)的抑制剂，研究PTK 的信号转导通路[9]。同时有研究发现，Genistein 作为PTK 抑制剂有效减弱神经保护肽[Gly14]-humanin(HNG)拮抗Aβ31-35 所致大鼠空间学习记忆损伤的保护作用[10]。我们推测低剂量的Genistein 可能表现雌激素样作用，而高剂量的Genistein 主要行驶PTK 抑制剂的功能来调节PTK的信号转到作用。

Genistein 不同剂量对抗Aβ1-40 诱导的神经毒性作用中所表现出不同的生物学作用的分子机制依然有待探索，信号转导和转录激活子（Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT3）是STAT 家族成员之一，可以在许多信号转到通路中发挥作用，负责将细胞外信号最终传递至细胞核，通过诱导靶基因转录表达来调节细胞的增殖，分化和凋亡从而影响炎症与肿瘤的形成[11]。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡机制网络中居中心地位，Caspase-3 作为Caspase 家族成员之一，则是细胞凋亡进程中的执行者，是最主要的终末剪切酶，发挥着不可替代的作用[12]。该研究发现，高剂量的Genistein 组海马组织中STAT3 的mRNA 相对表达量均明显降低，Caspase-3 的相对mRNA 的表达量均显著上升；低剂量的Genistein 处理组有效逆转Aβ1-40 诱导的海马组织内STAT3 和Caspase-3 基因表达的改变。综上所述，我们认为，STAT3/Caspase-3 可能是Aβ1-40 和Genistein 发挥功能的共同靶点，STAT3 mRNA 的上调以及Caspase-3 表达的压抑是低剂量Genistein 拮抗Aβ1-40 神经毒性作用的分子机制，而高剂量Genistein 却表现出相反的基因表达调节机制。

该研究通Y 迷宫实验探讨了不同剂量Genistein 对大鼠神经功能的不同影响，并利用real-time PCR 实验技术进一步明确不同剂量Genistein 在体内可能的分子机制，通过对Genistein 多重功能的实验研究来补充完善Genistein 生理机制，为临床的雌激素替代法治疗神经退行性疾病如AD 提供可靠的实验依据。

[1]McCarty MF.Isoflavones made simple -genistein's agonist activity for the beta-type estrogen receptor mediates their health benefits[J].Med Hypotheses,2006，66(6):1093-114.

[2]Bagheri M,MT Joghataei,S Mohseni,et al.Genistein ameliorates learning and memory deficits in amyloid beta(1-40)rat model of Alzheimer's disease.Neurobiol Learn Mem,2011，95(3):270-276.

[3]Choi EJ，BH Lee.Evidence for genistein mediated cytotoxicity and apoptosis in rat brain[J].Life Sci,2004，75(4):499-509.

[4]Ballard C，S Gauthier，A Corbett,et al.Alzheimer's disease[J].Lancet,2011，377(9770):1019-1031.

[5]Zanoli P，M Zavatti，E Geminiani,et al.The phytoestrogen ferutinin affects female sexual behavior modulating ERalpha expression in the hypothalamus[J].Behav Brain Res,2008，199(2):283-287.

[6]Bagheri M，MT Joghataei，S Mohseni,et al.Genistein ameliorates learning and memory deficits in amyloid β(1 -40)rat model of Alzheimer’s disease[J].Neurobiology of Learning and Memory,2011，95(3):270-276.

[7]Linford NJ,Y Yang,DG Cook,et al.Neuronal apoptosis resulting from high doses of the isoflavone genistein:role for calcium and p42/44 mitogen-activated protein kinase[J].J Pharmacol Exp Ther,2001，299(1):67-75.

[8]Linford NJ，DM Dorsa.17beta -Estradiol and the phytoestrogen genistein attenuate neuronal apoptosis induced by the endoplasmic reticulum calcium-ATPase inhibitor thapsigargin[J].Steroids,2002，67(13):1029-40.

[9]Bang OY,HS Hong,DH Kim,et al.Neuroprotective effect of genistein against beta amyloid-induced neurotoxicity[J].Neurobiol Dis,2004，16(1):21-28.

[10]原丽,韩维娜,李少凤,等.[Gly14]-humanin 拮抗Aβ31-35 引起的大鼠空间学习记忆损伤[J].生理学报,2012(6):625-632.

[11]Qi QR，ZM Yang.Regulation and function of signal transducer and activator of transcription 3[J].World J Biol Chem,2014,5(2):231-239.

[12]Porter AG,RU Janicke.Emerging roles of caspase-3 in apoptosis[J].Cell Death Differ,1999，6(2):99-104.