microRNA-101增强紫杉醇诱导非小细胞肺癌细胞凋亡

张积广

福建省立医院胸外科，福建福州 350001

非小细胞肺癌的发病率及病死率高，对放化疗不敏感，疗效欠佳。紫杉醇是非小细胞肺癌治疗的一线化疗药物，临床应用较广泛，其抗肿瘤机制主要是通过凋亡促使肿瘤细胞死亡，而凋亡抵抗是恶性肿瘤细胞的一个重要生物学特征，严重降低紫杉醇的治疗效果，因此有效提高紫杉醇促凋亡功能，可增强其抗肿瘤作用，提高其疗效。microRNA 是单链非编码小分子RNA，其在转录后水平调控基因的表达，是肿瘤学近年研究的热点，据文献[1]报道miRNA 可改变肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。该研究起止时间为2013年1月—2014年5月，旨在阐明miR-101 促进紫杉醇诱导非小细胞肺癌细胞凋亡，并探讨其可能机制，现报道如下。

1 方法

1.1 细胞培养

H358(支气管肺泡癌)和H226(鳞癌)细胞株购自ATCC，细胞株在含10% FBS、含双抗(100 IU 青霉素和100 μg/mL 链霉素)的RPMI-1640 培养液中培养。

1.2 miRNA-101mimics 和siRNA 的细胞转染

按照Lipofectamine 2000 说明书的步骤进行转染。将适当数量肺癌细胞接种于96 孔或6 孔板，细胞汇合度达到50%～60%时进行转染，转染后6 h，更换培养液为含10%FBS 的DMEM。

1.3 实时定量PCR

用Trizol 从细胞中提取总RNA。

①microRNA-101 表达检测

按逆转录试剂盒说明书将miRNA 逆转录为cDNA，将逆转录产物进行实时定量PCR 扩增，反应体系如下。

2×Real-time PCR Buffer 10 μL，miR specific Primer set(5μmol/L)0.6 μL miRNA RT product(物稀释3 倍)2 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.2 μL，dd H2O To 20 μL。混匀上述各组分，95 ℃3 min,95 ℃12 s，58 ℃40 s，40 个循环，PCR 反应在ABI 7500 荧光定量PCR 仪上完成。U6 作为内参，用2-△△ct 法计算。该实验重复3 次。

②EZH2-mRNA 表达检测

按逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录为cDNA，将逆转录产物进行实时定量PCR 扩增，反应体系如下。

上、下游引物各(10 μmol/L)1 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μL，逆转录产物(稀释10 倍)1 μL，Add H2O to final 25 μL。将上述各部分混匀。95 ℃60 s；95 ℃15 s，56 ℃15 s，72 ℃45 s，共40 个循环。

1.4 Western Blot

每个孔均加入细胞裂解液充分摇匀，在冰上作用30 min 后进一步离心后吸取上清液，蛋白浓度用Bi-Rad 蛋白测定试剂盒测定，-70℃保存于深低温冰箱。取30 μg 样品进行凝胶电泳、转膜，在室温下封闭1 h 后分别与相应一抗、二抗充分相互作用，最后用ECL 化学发光试剂进行检测。将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统分析。

1.5 细胞凋亡检测

将肺癌细胞接种于6 孔板中，转染方法同前，将每种细胞分为4 组即siRNA-EZH2 组、siRNA 阴性对照组及转染miR-101组、miRNA 阴性对照组。将紫杉醇（终浓度为40 nmol/L）加入转染72 h 后细胞，并孵育48 h。将收集的每组细胞分为俩份，一份用于Annexin V-FITC 凋亡检测，而另外一份用于western blot 检测凋亡相关蛋白，按试剂盒说明操作。

1.6 统计方法

所有数据均以SPSS13.0 统计软件包进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 miR-101 过表达或EZH2 基因沉默增强紫杉醇诱导的肺癌细胞凋亡

非小细胞肺癌H358 和H226 细胞株对紫杉醇的药物敏感性低，因而被用于该研究。EZH2 是miR-101 的靶基因，具有癌基因特性，促进非非小细胞肺癌的发生发展，因此将沉默EZH2 表的siRNA-EZH2 作为阳性对照。miR-101 mimics 或siRNA-EZH2转染细胞72 h 后再加入紫杉醇培养48 h，用流式检测细胞凋亡，结果表明miR-101 过表达或EZH2 基因沉默(图A)显著增强肿瘤细胞对紫杉醇敏感性，导致肿瘤细胞凋亡数量显著上升(图B 和图C)。

图A miR-101 mimics 或siRNA-EZH2 的转染效果通过实时定量PCR 检测miR-101 或EZH2 mRNA 的表达而确认。miR-101：转染miR-101 组；miR-CON：转染miRNA 阴性对照组；siRNA-EZH2：转染siRNA-EZH2 组；siCON：转染siRNA 阴性对照组。

图B annexin V-FITC/PI 双染流式细胞检测细胞凋亡。数据以相应阴性对照组作为标准化显示。Apoptotic cells：凋亡细胞。

图C 具有代表性流式细胞凋亡检测图显示miR-101 过表达或沉默EZH2 增强紫杉醇诱导的细胞凋亡。

2.2 miR-101 抑制EZH2 表达并增强凋亡相关蛋白Bim 和cleaved PARP 的表达

为了研究miR-101 增强肿瘤细胞对紫杉醇敏感性的可能机制，同时我们亦收集上述与紫杉醇培养48 h 后的肺癌细胞，用于检测凋亡相关蛋白。既往研究提示促凋亡蛋白Bim 是决定肿瘤细胞对紫杉醇敏感性的重要因子[2]，而EZH2 抑制Bim 表达[3]，所以我们检测凋亡相关蛋白EZH2、Bim、和cleaved PARP 的表达。该实验结果表明，EZH2 蛋白在miR-101 和siRNA-EZH2 转染细胞组的表达水平显著低于相应的阴性对照组，而Bim 和cleaved PARP 蛋白在miR-101 和siRNA-EZH2 转染细胞组的表达水平显著高于相应的阴性对照组(图D 和图E)。

图D Western blot 检测凋亡相关蛋白EZH2,Bim 和cleaved PARP的表达。β-actin 作为内参，数据以相应阴性对照组作为标准化显示。

图E 具体代表性的wenstern blot 条带显示miR-101 or siRNAEZH2 增加Bim 和cleaved PARP 蛋白的表达.以上所有实验均独立重复3 次。*P<0.05;** P<0.001。

3 讨论

非小细胞肺癌对化学药物治疗不敏感，且预后通常欠佳[4-6]，这种状况在过去的几十年中并未得到改善。紫杉醇是当前广泛应用于非小细胞肺癌治疗的临床一线药物，主要通过诱导细胞凋亡导致肿瘤细胞死亡，虽然其取得一定临床治疗成绩，但并不理想，若能进一步提高其疗效则有益于肺癌患者。因此，检测miR-101 能否增进紫杉醇诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡及其可能的机制值得进一步深入研究。该研究显示提高miR-101 表达或沉默EZH2 基因均能促进紫杉醇诱导肺癌细胞凋亡，同时亦降低EZH2 蛋白表达和增强Bim 蛋白表达。先前文献研究显示Bim能增进非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的药物敏感性，而下调Bim基因表达则显著减少紫杉醇导致的非小细胞肺癌细胞死亡，此表明Bim 是连接紫杉醇和凋亡之间的一个重要分子。EZH2 已经被证实能通过后生性抑制Bim 表达而减少肿瘤细胞凋亡。结合上述科研成果，研究结果提示miR-101 调节紫杉醇诱导非小细胞肺癌凋亡的机制如下：由miR-101 介导的EZH2 低表达诱导Bim 蛋白生成，因此增强紫杉醇诱导的非小细胞肺癌凋亡。

综上，在非小细胞肺癌中miR-101 能增强紫杉醇诱导的肺癌细胞凋亡。该研究结果提示miR-101 和EZH2 可能成为临床非小细胞肺癌治疗的潜在新靶点，有望改善非小细胞肺癌患者的临床治疗效果。

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