海洋放线菌BH3A8代谢产物杀线虫活性研究

田阳　何宗均　孙建华

摘 要：植物寄生线虫的危害日趋严重，利用生物防治技术是控制线虫危害的研究重点。对从渤海海域不同深度水样中筛选出的具有杀线活性的菌株BH3A8代谢产物进行研究，测定了BH3A8代谢产物杀线虫谱和对南方根结线虫的温室防效以及对松材线虫形态与运动频率的影响。结果表明，BH3A8代谢产物对南方根结线虫幼虫毒力最强，对松材线虫幼虫毒力次之，对大豆孢囊线虫幼虫毒力最弱。在温室测定中活性菌株发酵液对南方根结线虫防治效果为73.75%。活性菌株代谢产物明显抑制松材线虫运动频率。中毒线虫起初表现为虫体扭曲、颤抖、痉挛，接着线虫游动缓慢、扭动身躯，最后线虫反应迟钝，摆动减慢，首尾同侧展开，标志着线虫死亡。虫体死亡多为僵直状态。BH3A8杀线虫谱广、效果好、使用成本低，在生产上具有很好的应用前景。

关键词：海洋放线菌；活性菌株；杀线虫活性代谢物；毒力；防效

中图分类号：S476 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.003

线虫在自然界分布广泛，种类繁多，危害多种动物和植物。植物寄生线虫是植物侵染性病症主要病原之一，广泛寄生在各种植物的根、茎、叶、花、芽和种子上，一种植物可以有一种或者多种寄生线虫，使植物发生各种病变，严重阻碍了农林业的发展[1]。植物寄生线虫的种类已达100多属2 000多种[2-3]，农林业生产上的主要线虫约1 100种[4]。植物寄生线虫对农业生产的危害很大，其中危害主要农作物的寄生线虫约500多种，其危害程度超过了细菌和病毒，仅次于真菌病害[5-7]。严重危害我国农业、林业、经济作物的植物寄生线虫已达100多种，有些植物寄生线虫对作物的直接危害甚至比其他病、虫、草害都严重，一般只要作物上发生植物寄生线虫引起的病变，就可以使该作物减产10%～40%，在严重的情况下，可以减产70%～80%，最为严重的就是造成绝收[8-9]。

植物寄生线虫的非生物防治方法主要包括农业技术设施防治、抗性育种、物理防治和化学防治等4类。植物寄生线虫目前还是主要采取化学杀线虫剂进行线虫防治[10]，化学防治虽然效果好，但是其中大部分药剂对人畜有剧毒、用量高、花费大、严重污染环境和地下水源，破坏生态平衡，而且农药的残留污染直接影响农产品深加工的质量和品质，与此同时，化学农药在杀灭植物病原线虫的同时，也杀伤了天敌及其他有益生物，影响了生物多样性，破坏了生态平衡，化学杀线剂的应用正逐步受到限制[11-13]。所以生物防治成为研究热点。

在线虫的生物防治中，抗生素的应用是较为有效的防治途径之一。海洋占地表面积的71%，海洋中生态环境较陆地复杂多变，所以海洋放线菌会通过一些特殊的代谢途径来维持其生命活动。近十几年来，已经从海洋微生物及其代谢产物中发现了许多结构新颖、活性独特的活性物质，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、杀虫等活性。目前有很多利用海洋真菌代谢产物杀线的报道，但是杀线种类较单一[14]。海洋放线菌主要分布在海底沉积物、海洋生物表面以及海水中，天津地处渤海湾，拥有丰富的海洋资源，因此，从中筛选到有杀线活性的菌株是有很大几率的[15-17]。

海洋放线菌BH3A8是本课题组从渤海不同深度海水样品中筛选出的具有杀线活性的生防菌株。本试验着重对其杀线虫谱、温室防效以及对松材线虫形态与运动频率的影响的初步机理进行研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试菌株海洋放线菌BH3A8菌株是天津市农业资源与环境研究所微生物研究室筛选保藏的菌种。

1.2 试验方法

1.2.1 活性菌株BH3A8发酵液的制备 第1步，海洋放线菌菌株BH3A8的种子培养。挑取纯化菌株至种子培养液中，28 ℃，200 r·min-1，震荡培养3 d。第2步，海洋放线菌菌株BH3A8的发酵培养。配制发酵培养基，将种子液按1∶10比例转接至发酵培养液中，28 ℃，200 r·min-1，震荡培养7 d。将发酵液用甲醇萃取后旋转蒸发浓缩成8倍液后，放入-10 ℃冰箱保存。

1.2.2 供试线虫的制备 （1）松材线虫二龄幼虫（J2）的制备。参照文献[18]中松材线虫J2制备方法。在无菌操作条件下，将灰葡萄孢霉（Batrytiscinerea）接种于察氏培养基上，21 ℃下避光培养7 d，待菌丝长满培养皿后，将松材线虫接种于该菌丝上进行培养繁殖，26 ℃下避光培养5～7 d。通过贝尔曼（Baermann）漏斗法收集松材线虫，无菌水离心洗涤3次，2 000 r·min-1离心3次，每次3 min。用无菌水将离心得到的松材线虫稀释为1 000头·mL-1的悬液备用。

（2）南方根结线虫二龄幼虫（J2）的制备。参照文献[18]中根结线虫J2制备方法。取温室里接种南方根结线虫60 d后的番茄的根，将根剪成1～2 cm的小段；把根放于200 mL 1%的次氯酸钠溶液中，在豆浆机中搅拌剪切1～4 min；将悬浮液快速经孔直径0.15 mm，0.05 mm和0.03 mm的网筛，上下震荡网筛，在0.03 mm的网筛上即可收集到游离的卵；随即快速用无菌水冲洗0.03 mm的筛网上的的卵，以除去残留的次氯酸钠；再次冲洗震荡根段以获取更多的卵，用过筛法收集到离心管中，在底部加入40%蔗糖溶液20 mL梯度离心，3 500 r·min-1，5 min，吸取界面溶液过0.03 mm筛，用水冲洗筛子去除蔗糖，反向将卵冲入三角瓶中。将卵置于自制孵化器中，加无菌水放置在25～28 ℃环境条件下孵化；4 d左右会孵出大量的J2，收集到灭菌三角瓶中，置于4 ℃冰箱中备用[19]。

（3）大豆孢囊线虫二龄幼虫（J2）的制备。参照文献[18]中孢囊线虫J2制备方法。将大豆种植在温室的病原土壤中，孢囊成熟后挖出根系和根系周围土壤，用过筛法分离孢囊，选取新鲜饱满成熟的褐色孢囊放在自制孵化池中用0.5%次氯酸钠溶液消毒3 min，再用无菌水冲洗3遍，加入自制孵化池中，在25 ℃，4 mmol·L-1ZnCl2溶液中孵化。4 d左右会孵化出大量的J2，收集至灭菌的三角瓶中，置于4 ℃冰箱备用。

1.2.3 活性菌株BH3A8发酵液杀线虫谱的测定 采用梯度稀释法，在灭菌的96孔细胞培养皿中加入50 μL不同处理浓度的BH3A8菌株发酵液，以无菌水为阴性对照，以5×10-6的阿维菌素和苯线磷为阳性对照，分别向处理和对照中加入50 μL浓度为1 000 条·mL-1南方根结线虫、松材线虫和大豆孢囊线虫3种不同线虫，4次重复，放入25 ℃生化培养箱中，24 h后观察线虫形态，僵直或卷曲不动的虫体视为死亡，记录线虫死亡率，计算校正死亡率，线虫死活判断采用NaOH刺激法[20]。

死亡率=（死亡线虫数/总线虫数）× 100%

校正死亡率= [处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率/1-对照组线虫死亡率] ×100%

1.2.4 活性菌株BH3A8发酵液对南方根结线虫的温室防治效果 在平均温度26 ℃左右、湿度68%左右的温室大棚中，将黏土和沙子按1∶3混合，干热灭菌后，放入15 cm×15 cm的塑料钵内，每钵1 kg，之后移入三叶期番茄幼苗，每盆使用4倍放线菌BH3A8菌株发酵液50 mL进行灌根处理，以清水作为阴性对照，5×10-6的苯线磷作为阳性对照，培养5 d后，在植物根周围均匀地插3个小孔，将配置好的南方根结线虫卵悬浮液滴入小孔中，每盆接种1 000个虫卵。培养45 d后，根据根部症状评定病情指数，计算防治效果，并测量番茄植株的根长和根重。试验采用随机区组设计，每个处理20个重复。

病情指数分级标准为：0级，健康无病（根系上无根结）；1级，1%～20%根系上有根结，但根结相互不连接；2级，21%～40%的根系上有根结，仅少量根结相互连接；3级，41%～60%的根系上有根结，半数以下根结相互连接；4级， 61%～80%的根系上有根结，半数以上根结相互连接，部分主、侧根变粗呈畸形；5级，80%以上的根系上有根结，且相互连接，多数主、侧根呈畸形。

病情指数=[Σ（各级病根数×级数）/调查株数×5] ×100%

防治效果=（对照病情指数-处理病情指数/对照病情指数）×100%

1.2.5 活性菌株BH3A8代谢产物对松材线虫运动频率及形态变化的影响 （1）松材线虫处理方法。线虫的收集方法同上介绍的，用无菌水将离心得到的线虫稀释为约15 000 头·mL-1的悬液，每200 μL分装于灭菌的玻璃瓶中，同时分别加入两株菌的代谢产物原液2 mL[21-23]，迅速混匀，计时测量，加灭菌水作对照，置于26 ℃培养箱中；（2）观测方法。在供试线虫分别处理0，2，4，8，16，24 h后，取平行对照和处理同时观察。具体方法为取含10条左右线虫的混合液点于表面皿上，室温26 ℃解剖镜下观察线虫的形态变化和摆动频率，同时用显微成像仪进行记录；每个处理均观测3次，摆动频率取3次观测值的平均值[24]。

2 结果与分析

2.1 活性菌株BH3A8发酵液对3种线虫幼虫活性的影响

BH3A8菌株发酵液对南方根结线虫、松材线虫和大豆孢囊线虫幼虫均有较好的抑制作用，对南方根结线虫抑制效果最好、松材线虫次之，对大豆孢囊线虫效果最差。稀释4倍的活性菌株发酵液对大豆孢囊线虫、南方根结线虫、松材线虫的致死率均为100%；稀释16倍后，对南方根结线虫、松材线虫的致死率仍为100%，但对大豆孢囊线虫致死率显著下降，仅为13.11%。活性菌株发酵液对南方根结线虫的抑制作用明显高于松材线虫，稀释24倍后，对南方根结线虫的致死率为100%，但对松材线虫的致死率为46.31%。

2.2 活性菌株BH3A8发酵液对南方根结线虫温室防效

在温室，对盆栽番茄用BH3A8发酵液的4倍稀释液进行灌根处理，培养45 d后对各指标进行调查，结果见表2。

活性菌株的温室试验结果表明，菌株BH3A8发酵液对南方根结线虫的防效达73.75%，阳性药物苯线磷对南方根结线虫防效为81.25%，活性菌株发酵液对南方根结线虫的防效与阳性药物防效相当。此活性菌株代谢产物不仅在实验室测定中表现出了很高的杀线活性，在温室测定中同样表现出了较高的防效，具有开发成为线虫生防制剂的潜能。

2.3 活性菌株BH3A8代谢产物对松材线虫运动频率及形态变化的影响

由结果可知，在2 h处理时间内，处理组和对照组在刺激前后运动频率有微小变化，但并不是很明显；处理时间达到4 h后，对照组和处理组相比有较明显的变化，分别为1.18 次·s-1和0.88 次·s-1；8 h时，对照组与处理组的平均频率有了明显变化，分别为1.02 次·s-1和0.62 次·s-1，线虫反应缓慢；16 h时，对照组与处理组平均频率有了明显变化，分别为0.99 次·s-1、0.36 次·s-1，处理组线虫仅有少部分偶尔极其缓慢地伸展开，处理前后，16 h处理组的反应灵敏度和运动频率同4 h处理组运动频率相比，几乎呈等比下降，说明线虫的反应灵敏度及运动能力均随着处理时间的增加几乎呈线性下降趋势；至24 h，对照组平均频率为0.97 次·s-1，处理组的平均运动频率为0 次·s-1，线虫全部僵直死亡。根据线虫的运动频率，可以看出，处理组的线虫运动频率远远低于对照组的运动频率，即BH3A8的16倍稀释发酵滤液减缓线虫运动频率的效果很明显。

2.3.2 BH3A8活性代谢产物对松材线虫形态的影响 在试验过程中，观察到中毒线虫起初表现为虫体扭曲、颤抖、痉挛，接着线虫游动缓慢、扭动身躯，最后线虫反应迟钝，偶尔扭动身躯，直至线虫死亡、虫体僵直（图2）。

正常的线虫形态为图2（a）所示的“S”型，随着时间的延长，发酵液处理后线虫形态发生变化。处理组线虫在短时间内（<8 h）由正常的“S”型大量转变为应激性的扭曲和缠绕状态，有“Ω”型和“ξ”型如图2（b，c），随着时间的延长，中毒加深，虫体由应急状态转变为延伸状态，有“7”型和“C”型如图2（d，e），这一过程，以头尾同向为显著特征，是线虫濒死的形态和行为标记，最终成C形和直挺状，线虫死亡如图2（f）。其濒死过程的行为特征表现为应激性的扭动频率加快、滚动纽结，进而痉挛性抖动，随后线虫的动频减缓、摆幅减小、应激反应迟钝，虫体呈头尾同侧展开，标志着线虫即将死亡。死亡虫体多呈僵直状态。发酵滤液处理的线虫与对照相比，线虫的运动有明显的减慢趋势，明显影响线虫的活力。形态学的变化也证明了该菌株的发酵滤液确实有杀线虫的活性，而对于线虫的中毒机理有待于今后继续研究。

3 结论与讨论

放线菌菌株发酵液活性成分复杂，不同成分对不同线虫的活性位点作用也不尽相同，所以同一菌株的发酵液对不同种类线虫的生物活性存在很大的差异。菌株发酵液对于3种不同线虫J2均有一定抑制作用。温室防效试验中该菌株发酵液防效与阳性对照相当，具有开发成环境友好生物农药的潜能，北方蔬菜大棚种植面积大，蔬菜根结线虫侵染严重，若将其应用于生产将对蔬菜根结线虫防治产生重大影响。菌株发酵液对松材线虫活动有明显抑制作用，其作用机理有可能是抑制神经传递。BH3A8是一株具有广泛应用前景的生物防治菌株，对该菌代谢产物中活性物质的分离纯化和致死机理还需进一步研究。

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3 结论与讨论

放线菌菌株发酵液活性成分复杂，不同成分对不同线虫的活性位点作用也不尽相同，所以同一菌株的发酵液对不同种类线虫的生物活性存在很大的差异。菌株发酵液对于3种不同线虫J2均有一定抑制作用。温室防效试验中该菌株发酵液防效与阳性对照相当，具有开发成环境友好生物农药的潜能，北方蔬菜大棚种植面积大，蔬菜根结线虫侵染严重，若将其应用于生产将对蔬菜根结线虫防治产生重大影响。菌株发酵液对松材线虫活动有明显抑制作用，其作用机理有可能是抑制神经传递。BH3A8是一株具有广泛应用前景的生物防治菌株，对该菌代谢产物中活性物质的分离纯化和致死机理还需进一步研究。

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3 结论与讨论

放线菌菌株发酵液活性成分复杂，不同成分对不同线虫的活性位点作用也不尽相同，所以同一菌株的发酵液对不同种类线虫的生物活性存在很大的差异。菌株发酵液对于3种不同线虫J2均有一定抑制作用。温室防效试验中该菌株发酵液防效与阳性对照相当，具有开发成环境友好生物农药的潜能，北方蔬菜大棚种植面积大，蔬菜根结线虫侵染严重，若将其应用于生产将对蔬菜根结线虫防治产生重大影响。菌株发酵液对松材线虫活动有明显抑制作用，其作用机理有可能是抑制神经传递。BH3A8是一株具有广泛应用前景的生物防治菌株，对该菌代谢产物中活性物质的分离纯化和致死机理还需进一步研究。

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