赖氨大黄酸与顺铂联合对人肺癌A549细胞系增殖和凋亡的影响

纪春梅，甄永占，范晓禹，王志军，蒋守芳，朱丽华，章广玲

大黄酸(rhein)是许多中药尤其是大黄的主要有效成分。可抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，具有广泛的生物学活性［1－3］。蒽醌类化合物的共同特点是不溶于水，限制了其在肿瘤治疗方面的应用。本实验室对大黄酸进行结构改造获得了水溶性好的赖氨大黄酸(rhein lysinate，RHL)。本研究观察RHL联合顺铂对人肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制，为今后大黄酸在肿瘤治疗中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及细胞系

1.1.1 试剂:赖氨酸(北京市科海军舟生物科技发展中心)。赖氨大黄酸(rhein lysinate，RHL)由本室合成，分子式:C21H22N2O8，相对分子质量:430，纯度93%;顺铂(中国医学科学院肿瘤研究所);蛋白定量试剂盒(BCATMprotein assay kit)(Pierce公司产品);宽范围蛋白预染 Marker(New England Biolabs公司);蛋白质印迹发光液和PVDF膜(Millipore公司);FITC-AnnexinⅤ 凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司);BCL-2抗体(sc-492)、BAX 抗体(sc-493)、β-actin抗体(sc-1616)(Santa Cruz公司);HRP标记的羊抗兔、兔抗羊和羊抗小鼠IgG抗体(北京中杉金桥有限责任公司);丝裂原活化蛋白激酶家族成员抗体试剂盒、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶家族成员抗体试剂盒和凋亡相关分子抗体试剂盒(Cell Signaling Technology公司)。

1.1.2 细胞系分组及处理:人肺癌细胞系(A549)由河北联合大学中心实验室传代保存。用含10%胎牛血清(Hyclone)的高糖DMEM培养液(Gibco公司)，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，2 d传代1次，实验用细胞为对数生长期细胞，分对照组、1μmol/L顺铂组、100μmol/L RHL组以及1μmol/L顺铂和100 μmol/L RHL 联合用药组［4－5］。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖活性检测:应用MTT法检测定细胞存活率。取对数生长期的细胞，轻轻吹打分散成细胞悬液，记数后以4×103个/孔细胞接种于96孔培养板中，每孔200μL培养液，24 h后分别加入1μmol/L的顺铂、100μmol/L的RHL以及1μmol/L的顺铂和100μmol/L的RHL联合用药处理48 h，每组至少3个平行孔。实验结束前加入5 g/L MTT 20μL，继续培养4 h后小心吸去上清液，加入二甲基亚砜150 mL，振荡溶解结晶后用酶标仪(Thermo Labsystems公司，Multiskan MK3)于570 nm 处测定每个孔的吸光度(A570)值。实验设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔，按下面公式计算细胞的存活率:细胞存活率=(加药组A570值－空白组A570值)/(对照组A570值 －空白组 A570值)×100%。实验重复3次。

1.2.2 膜联蛋白V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡:取对数生长期细胞3 mL按5×104个/孔种于6孔板，24 h后分别加入顺铂、RHL以及顺铂和RHL联合用药，继续培养48 h，收集细胞，按说明书操作，在流式细胞检测仪上检测凋亡。

1.2.3 蛋白质提取及Western blot检测:分别收集顺铂、RHL以及顺铂和RHL联合用药作用48 h及未加药处理的A549细胞，用预冷的1×PBS洗3遍，加入新鲜配制的细胞裂解液(50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸，pH 7.5;1%NP-40;150 mmol/L NaCl;1 mmol/L Na3VO4;1 mmol/L NaF，临用时加入3种蛋白酶抑制剂:1% 抑蛋白酶肽;10 g/L亮抑酶肽;1 mmo/L苯甲基磺酰氟)100μL，细胞与裂解液充分混合，冰浴20 min。于4℃、13 000 r/min离心15 min，收集上清液于新的微量离心管中，采用BCA法测定蛋白含量。取各样品等量总蛋白30μg加入0.25倍体积的5×上样缓冲液，煮沸变性5 min后，在10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)胶上进行电泳。然后转移到硝酸纤维素膜上，1% 牛血清白蛋白封闭1 h，一抗4℃孵育过夜后，加相应二抗孵育2 h，膜上滴加化学发光增强剂(Santa Cruz biotechnology SC-2048)，按照试剂说明进行操作，通过凝胶成像系统拍照保存结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，单因素方差分析比较各组间的差异，采用t检验进行两组之间比较。

2 结果

2.1 顺铂和RHL单独或联合作用后细胞增殖率

给药48 h后，顺铂和RHL联合用药组细胞增殖抑制作用明显高于顺铂和RHL单独用药组，顺铂和RHL单独用药组对细胞的增殖也有抑制作用(p＜0.05)，顺铂和RHL联合用药后对细胞增殖抑制作用明显提高(p＜0.05)(图1)。

图1 顺铂和RHL单独或联合作用后细胞增殖率Fig 1 Growth inhibition of A549 cells treated with cisplatin，RHL，and a combination of both

2.2 顺铂和RHL单独或联合作用后细胞凋亡率

顺铂和RHL单独用药组的细胞凋亡率分别为18.86% ±1.20%和22.38% ±1.50%，均显著高于对照组的2.81% ±0.50%(p＜0.05)，顺铂和RHL联合用药组细胞凋亡率为52.51% ±1.90%，均显著高于单独用药组(p＜0.05)(图2)。

2.3 Western blot法检测顺铂和RHL单独或联合作用细胞后凋亡相关蛋白和ERK的表达水平

顺铂组磷酸化的ERK蛋白表达水平高于对照组，RHL组磷酸化的ERK蛋白表达水平与对照组相比没有明显变化，而顺铂联合RHL组磷酸化的ERK的表达水平明显低于单独应用顺铂组。顺铂联合RHL组的caspase-3、caspase-7和poly ADP-ribose polymerase(PARP)的切割片段蛋白表达水平高于顺铂组和RHL组(图3)。

2.4 Western blot法检测顺铂和RHL单独或联合作用细胞后BCL-2和BAX蛋白的表达水平

顺铂和RHL单独或联合作用细胞48 h后，联合组的BCL-2的表达水平低于单独用药组，而BAX的表达水平高于单独用药组(图4)。

图2 顺铂和RHL单独或联合作用后细胞凋亡率Fig 2 Apoptosis of A549 after treated with cisplatin，RHL and a combination of both

图4 A549细胞BCL-2和BAX蛋白的表达水平Fig 4 Expression levels of BCL-2 and BAX in A549 cells detected

图3 A549细胞ERK和凋亡相关蛋白的表达水平Fig 3 Expression levels of protein associated with apoptosis and ERK in A549 cells detected

3 讨论

肺癌已成为我国前10位恶性肿瘤死亡率的第1位，在许多国家也是首位的癌症致死原因。化疗在肺癌的综合治疗中占据着重要的地位，顺铂作为肺癌化疗中常用的药物，虽有一定的效果，因其对正常组织的毒性和耐药性，所以仍不够理想，故寻找高效低毒的肿瘤化疗增敏剂以增强顺铂的化疗效果，改善患者的生存率成为研究热点。

大黄酸是许多中药尤其是大黄的主要有效成分。可抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，具有广泛的生物学活性［1－3］。对大黄酸进行结构改造获得了水溶性好的RHL，并证实RHL保留了抗肿瘤活性［6－8］。本研究发现:顺铂和 RHL均能抑制肺癌A549细胞增殖并诱导其凋亡，但两药联合后增殖抑制作用和凋亡诱导作用显著高于单用顺铂或RHL;两药联合进一步增加了 A549细胞 caspase-3、caspase-7和PARP的切割片段蛋白表达。提示RHL能够通过调控caspases家族增强顺铂对A549细胞的凋亡诱导作用。

本研究还发现两药联合显著下调了BCL-2蛋白的表达，而BAX蛋白的表达升高。BCL-2是一种抗凋亡蛋白，BAX是促凋亡蛋白，BCL-2/BAX的比例决定细胞的生存与凋亡［9］。同时RHL还能降低顺铂上调的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)蛋白磷酸化。ERK的激活有利于细胞生存，也是肿瘤耐药的常见原因［10－12］。

综上所述，RHL能够通过抑制顺铂对ERK的激活增强顺铂对肺癌细胞增殖和凋亡诱导作用。可见RHL不仅自身有抗肺癌作用，而且还可以增强顺铂对肺癌A549细胞的杀伤作用和凋亡诱导作用，减少毒副作用，进一步研究RHL和顺铂两者联合治疗肺癌的作用机制和作用途径，可能为肺癌的综合防治提供新思路、新线索和新方法。

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