龙脷叶提取物体外抑菌活性初步研究

黄 燕 谭建宁 马雯芳

（广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530001）

龙脷叶为大戟科植物龙脷叶Sauropus spatuli folius Beille的干燥叶，主要分布在广西、广东、福建等地，《广西本草选编》（第一版）和《广西药用植物名录》均有收载[1-2]。龙脷叶既可食用又可入药：壮药记载龙脷叶能通气道、谷道，润肺止咳，滑肠通便，因润肺止咳的功效而用于治疗埃病（咳嗽），胸闷，阿意囊（便秘），是临床上常用壮药[3]。2010 版《中国药典》将龙利叶收载其中，其性甘、淡、平; 归肺、胃经；具有润肺止咳，通便等功效; 主要用于肺燥咳嗽，咽痛失音，便秘等[4]。华南地区民间常用它煲凉茶以祛痰化湿，也可与瘦猪肉或猪肺同煮，治疗肺热咳嗽、失音、喉痛、急性支气管炎、上呼吸道炎等症。有文献报道[5]，龙利叶的提取液对金黄色葡萄球菌、血液性链球菌有明显的抑制作用，但是对龙脷叶抑菌活性成分的研究工作还不够系统和深入。本研究通过考察龙脷叶醇提取物对六种常见呼吸道、肠道致病菌的体外抑菌作用，筛选出龙脷叶的抗菌活性部位，为进一步分离活性成分及其综合开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

（1）材料。龙脷叶2013年4月购于玉林药材批发市场，经广西中医药研究院严克俭助理研究员鉴定，为大戟科植物龙脷叶Sauropus spatuli folius Beille的干燥叶。粉碎成粗粉（过20目筛），待用。

（2）供试菌株。金黄色葡萄球菌（ATCC 26003）、大肠杆菌（ATCC 44102）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、伤寒沙门氏菌（ATCC 50075）均购自中国食品药品检定研究院；金黄色葡萄球菌耐药株、乙型副伤寒沙门氏菌由广西中医药大学微生物教研室保存并提供。

（3）仪器与试剂。无菌净化工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；电热恒温培养箱（上海医疗器械七厂）；压力蒸汽灭菌器（上海医用核子仪器厂）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂），KQ5200B型超声提取仪，RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），恒温水浴锅（DK-98-∏A）。营养琼脂（BR），石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亚砜（DMSO）均为分析纯，水为蒸馏水。

1.2 试验方法

（1）龙脷叶提取物的制备。取龙脷叶粗粉 50g，分别用10 倍量的50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇80℃回流提取两次，每次2 h，滤过，合并滤液得到龙脷叶不同浓度乙醇的提取液。将以上龙脷叶醇提取液旋转蒸发并挥干溶剂，得到乙醇浸膏。用20%的二甲基亚砜分别溶解后得到龙脷叶50%乙醇提取物、70%乙醇提取物和95%乙醇提取物，浓度分别为0.5 g·mL-1（按每毫升所含的生药计），灭菌后放冰箱保存备用。另取龙脷叶粗粉50g，加入500ml 蒸馏水，超声提取1小时，浓缩得到浸膏。用20%的二甲基亚砜溶解，得到龙脷叶水提取物，浓度为0.5 g·mL-1（按每毫升所含的生药计），灭菌，备用。

（2）龙脷叶50%乙醇提取物不同萃取部位的制备。取龙脷叶粗粉50g，加10 倍量的50%乙醇于80℃回流提取2h，滤过。50%乙醇提取液旋转蒸发并挥干溶剂，得到浸膏。浸膏以水分散均匀，用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次进行萃取分离。将各萃取层真空浓缩至干，用20%的二甲基亚砜分别溶解后得到得石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相。浓度分别为0.5 g·mL-1（按每毫升所含的生药计），灭菌后放冰箱保存备用。

（3）MH培养基的制备。称取营养琼脂76g，加蒸馏水1000mL，按常规方法配制，于高压蒸汽灭菌（0.15 MPa，125℃，30 min）后置于50℃水浴平衡，备用。

（4）供试菌的活化及菌悬液的制备。首先把金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌耐药株、乙型副伤寒沙门氏菌在MH培养基的斜面上传3次，使其生长稳定，状态良好。在制好的平板上划定区域后用2μL定量接种环进行细菌接种。将供试菌株分别接种于MH平板上，待接种点菌液干后，置 37 ℃ 恒温培养箱培养24 h，进行活化。挑取活化后的各菌种置于无菌生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏单位的菌液，然后稀释10倍（约含菌1.5 × 107CFU·mL-1）。稀释后菌液应在15 min 内接种完毕。

1.3 最低抑菌浓度（MIC）的测定

（1）龙脷叶提取物最低抑菌浓度的测定。[6]采用连续二倍梯度琼脂稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）。分别取10 mL龙脷叶水提取物、50%乙醇提取物、70%乙醇提取物和95%乙醇提取物（0.5 g·mL-1），加入10 mL灭菌蒸馏水（0.15MPa，125 ℃，30 min灭菌），在MH培养基中充分混匀，制备厚度为4mm，内径为90mm的含药平板，每块含药平板含有龙脷叶提取物的浓度分别为250、125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.91、1.95、0.976、0.488 mg·mL-1（按每毫升所含的生药计）等10个浓度，冷却凝固，在含药平板上划定区域，每个平皿中加入菌悬液0.1 mL，用涂布棒涂布均匀，平板置 37 ℃ 恒温培养箱培养24 h后后观察结果，以无细菌生长的提取物最低浓度为最低抑菌浓度。同时设20%的二甲基亚砜为空白对照。各浓度含药平板平行制备三份。

（2）龙脷叶50%乙醇提取物不同萃取部位最低抑菌浓度的测定。采用连续二倍梯度琼脂稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）。取15 mL龙脷叶50%乙醇提取物（0.5 g·mL-1），加入15 mL灭菌蒸馏水（0.15MPa，125 ℃，30 min灭菌），在MH培养基中充分混匀，制备厚度为4mm，内径为90mm的含药平板，每块含药平板含有龙脷叶提取物的浓度分别为250、125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.91、1.95、0.976、0.488 mg·mL-1（按每毫升所含的生药计）等10个浓度，冷却凝固，在含药平板上划定区域，每个平皿中加入菌悬液0.1 mL，用涂布棒涂布均匀,平板置 37 ℃ 恒温培养箱培养24 h后后观察结果，以无细菌生长的提取物最低浓度为最低抑菌浓度。同时设盐酸环丙沙星（5mg·mL-1）的平板为阳性对照，20%的二甲基亚砜为空白对照。各浓度含药平板平行制备三份。

2 结果与分析

2.1 龙脷叶提取物最低抑菌浓度（MIC）试验结果

将六种供试菌株，按每系列浓度平行测定三次，重复观察，所得结果见表 1。从表 1 可知，龙脷叶水提取物和50%乙醇提取物对六种供试菌株均有较好的抑菌作用，两者比较，以50%乙醇提取物抑菌效果最好，其最小抑菌浓度在31.3～62.5 mg·mL-1之间；龙脷叶50%乙醇提取物对六种供试菌株均有较好的抑菌作用，其最小抑菌浓度在31.3～62.5 mg·mL-1之间；龙脷叶70%乙醇提取物仅对金黄色葡萄球菌有明显抑菌作用，其最小抑菌浓度在62.5～125mg·mL-1之间；龙脷叶95%乙醇提取物对六种供试菌株的抑菌作用均不明显，其最小抑菌浓度在125～250mg·mL-1之间。由此结果，我们选择抑菌作用较强的50%乙醇提取物做进一步的分部位萃取，测定龙脷叶不同溶剂提取物的最低抑菌浓度（MIC），观察其不同溶剂提取物的抑菌效果。

表1 龙脷叶不同溶剂提取物最低抑菌浓度（MIC）测定结果（n=3）

2.2 龙脷叶50%乙醇提取物不同萃取部位最低抑菌浓度（MIC）试验结果

对龙脷叶 50%乙醇提物三个萃取部位分别进行最低抑菌浓度（MIC）的测定，结果见表2。从表 2 可知，龙脷叶醇提物石油醚部位对伤寒沙门氏菌的抑菌作用最强，对六种供试菌株的 MIC分别为：对金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药株和铜绿假单胞菌的MIC为250mg·mL-1，对大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌的MIC为125 mg·mL-1，对伤寒沙门氏菌的MIC为62.5 mg·mL-1；龙脷叶醇提物乙酸乙酯部位对六种供试菌株的抑菌作用均不明显，其 MIC分别为：对金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药株和乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌的MIC为250mg·mL-1，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌的MIC为125 mg·mL-1；龙脷叶醇提物正丁醇部位对六种供试菌株均有明显的抑菌作用，其 MIC分别为：对金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药株、大肠杆菌的MIC为15.6 mg·mL-1，对铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌的MIC为7.81 mg·mL-1。

表2 龙脷叶50%乙醇提取物不同萃取部位最低抑菌浓度（MIC）测定结果（n=3）

3 讨论与结论

（1）龙脷叶（Sauropus spatuli folius Beille）常用于治疗上呼吸道炎症引起的咳嗽，咽痛、急性支气管炎等症，故本试验选择常见的六种呼吸道、肠道致病菌，即革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、金黄色葡萄球菌耐药株（Methicillin resistant Staphylococcus aureus）和革兰氏阴性菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）和乙型副伤寒沙门氏菌（Bacillus paratyphosus B）进行体外抑菌作用，结果表明龙脷叶乙醇提取物具有一定的体外抑菌作用。

（2）环丙沙星为合成的第二代喹诺酮类抗菌药物,具广谱抗菌活性，杀菌效果好，试验采用盐酸环丙沙星作为阳性对照考察抑菌效果，结果龙脷叶醇提物正丁醇部位对六种试验菌株的MIC在7.81～15.6 mg·mL-1之间，阳性对照盐酸环丙沙星对六种试验菌株的MIC均为 1.95 mg·mL-1，MIC相差4-8倍，表明龙脷叶醇提物正丁醇部位的抑菌效果明显。

（3）本试验采用连续二倍梯度琼脂稀释法测定 MIC，并以MIC的测定结果分别对50%、70%和95%三种浓度的乙醇提取物的抑菌作用进行跟踪提取，再对抑菌效果明显的50%的乙醇提取物进行分极性部位的MIC测定，确定抑菌活性部位。

（4）以 20%的二甲基亚砜作为龙脷叶提取物的溶剂，既能增加溶解度，又不会造成干扰，经空白对照试验对龙脷叶提取物的抑菌作用无影响。

（5）本研究对龙脷叶体外抑菌活性进行了初步研究，下一步的研究工作我们将对其进行活性指导下的活性化合物的进一步分离纯化以及结构解析，对单体的抗菌活性及抗菌机制进行深入的研究和探索。

[1] 广西壮族自治区革命委员会卫生局主编.广西本草选编[M].第一版.南宁:广西人民出版社,1974,1259.

[2] 广西壮族自治区中医药研究所编.广西药用植物名录[M].广西:广西人民出版社,1986:198.

[3] 广西壮族自治区食品药品监督管理局.广西壮族自治区壮药质量标准2008年版(第一卷)[M].广西:广西科学技术出版社,2008: 77.

[4] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:2010 年版一部[S].北京:中国医药科技出版社, 2010: 90.

[5] 李秉滔;草药龙鶪叶原植物的考证[J].华南农学院学报,1981,2(1):41.

[6] 临床微生物学和微生物检验实验指导[M].北京:人民卫生出版社,2006: 42-43.