肉豆蔻挥发油体外抗病原微生物活性研究＊

胡 杰，代 娟，王城城，陈玉平，唐婉林，代 敏，万 莉

成都医学院 检验医学院（成都 610500）

肉豆蔻具有温中行气、涩肠止泻之功效，用于脾胃虚寒、久泻不止、脘腹胀痛和食少呕吐［1］，在蒙药中主治心赫依、心刺痛、谵语、晕厥和心慌等诸多心脏疾病［2］。现代研究［2］表明，肉豆蔻的化学成分主要包括挥发油、脂肪油、苯丙素、木脂素和黄酮等药理活性成分，具有抗感染、抗氧化、镇痛、止泻、抗血栓、抗细胞凋亡、降血脂、抗血小板聚集、抗溃疡、抗心律失常、抗肿瘤、壮阳等广泛的药理活性［2－7］。

目前，关于肉豆蔻的抗细菌活性研究较多，既有肉桂水提物、甲醇、乙醇提取物和肉豆蔻挥发油的抗细菌活性研究［8－11］，亦有单体成分的抗细菌活性研究［4］，如肉豆蔻氯仿萃取物中分离的三肉豆蔻酸甘油酯、肉豆蔻酸、甘油十四酸酯［12］，以及甲醇提取物中分离的肉豆蔻木酚素等。但这些研究都侧重于定性分析，鲜有定量分析，难以有效比较不同研究的结果。对于肉豆蔻抗真菌活性研究报道较少，仅有肉豆蔻挥发油抗青霉、黑曲霉、黄曲霉、产黄青霉、根霉［13－14］，以及甲醇提取物中分离的肉豆蔻木酚素抑制植物病原真菌［15］的研究报道，未见有肉豆蔻抗白假丝酵母菌真菌活性的研究报道。基于此，本研究拟对肉豆蔻主要活性部位挥发油抗临床分离细菌和白假丝酵母菌真菌的抑菌活性进行定量比较研究，为后续肉豆蔻在抗感染性疾病中的开发与应用等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药物

肉豆蔻购自成都同仁堂，水蒸气蒸馏法提取其挥发油，挥发油的提取方法参考文献［1］。

1.2 菌种

1.2.1 标准株 1）细菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300，购自美国临床实验室菌种保藏中心；大肠埃希菌 ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923由四川抗菌素工业研究所赠送；大肠埃希菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003购自四川省食品药品检验所。2）白假丝酵母菌：白假丝酵母菌ATCC14053，购自美国临床实验室菌种保藏中心；白假丝酵母菌CICC32819、白假丝酵母菌CICC1284，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2.2 临床分离株 1）细菌：分离于四川省妇幼保健院和成都医学院第一附属医院门诊患者，共16种67株（表1）。2）白假丝酵母菌：分离于四川省妇幼保健院门诊患者，并经BIO－KONT公司的KC－16鉴定板条与药敏纸片鉴定，共14株（表2）。

1.3 培养基、试剂及耗材

沙氏琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司），Mueller－Hinton agar（MH 琼脂），营养琼脂（北京奥博星生物技术有限责任公司）等。

1.4 主要仪器

VITEK DENSICHEK（法国梅里埃公司生产），多点接种仪（SAKUMA MIT－P型，日本佐久间生产），CO2INCUBATOR（MOC－15A）等。

1.5 实验方法

参考美国临床实验室标准化协会抗微生物药物敏感性试验执行标准［16］，采用琼脂平板2倍稀释法测定肉豆蔻油对细菌和真菌的最低抑菌浓度（MIC）。

1.5.1 含药平板制备 采用倍比稀释法，用1%吐温－80溶液把药物稀释成13个梯度，在无菌培养皿中分别加入14mL灭菌的MH琼脂或沙氏琼脂，以及1mL不同浓度梯度的稀释药液，充分混匀，制备不同浓度梯度的含药平板，自然干燥后备用。平板内分别以1%吐温－80溶液和1mL无菌蒸馏水代替药物制备溶剂对照和阳性对照平板。

1.5.2 菌液制备 将实验菌株用无菌生理盐水调至菌液浓度1.5×106CFU／mL。

1.5.3 MIC测定 用多点接种仪将受试菌液加入含药平板和对照平板，37℃恒温培养18～24h，观察菌株生长情况。以无细菌生长平板内药物的最小浓度为肉豆蔻挥发油对该菌株的MIC。

1.6 统计学方法

用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析法统计分析肉豆蔻挥发油对不同种属菌株抑菌活性的强弱，P＜0.05为差异有统计学意义。4株以上同种属菌株，分析药物抑制其50%和90%菌株的MIC，即 MIC50和 MIC90。

2 结果分析

2.1 肉豆蔻挥发油体外抗细菌活性

琼脂平板2倍稀释法测定肉豆蔻挥发油对金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌等16种细菌的MIC，结果表明肉豆蔻挥发油对不同种类的细菌有不同程度的抑制作用，其中对表皮葡萄球菌的抑菌活性最强，MIC为0.07～0.13mg／mL；对铜绿假单胞菌的抑菌活性最差，MIC为4.25～8.50mg／mL；对其余受试菌株呈中等程度抑菌活性，MIC主要集中于0.27～1.06mg／mL（表1）。

表1 肉豆蔻挥发油的体外抗细菌活性

2.2 肉豆蔻挥发油体外抗真菌活性

琼脂平板2倍稀释法测定肉豆蔻挥发油对白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌临床分离株的体外抑菌活性，结果表明肉豆蔻挥发油对白假丝酵母菌（MIC为0.07～0.53mg／mL）和非白假丝酵母菌（MIC为0.07mg／mL）具有较强的体外抑菌活性，说明肉豆蔻挥发油具有明显的体外抗真菌活性（表2）。

表2 肉豆蔻挥发油的体外抗真菌活性

2.3 肉豆蔻挥发油对不同种类病原微生物的抑菌活性比较

采用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析法统计肉豆蔻挥发油对4株以上受试菌种的抑菌活性强弱，并比较MIC50和MIC90。结果表明：肉豆蔻挥发油抗真菌活性总体强于抗细菌活性，其中对白假丝酵母菌真菌的抑菌活性明显强于金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌（P＜0.01）；肉豆蔻挥发油对肺炎克雷伯菌和洛菲不动杆菌的抑菌活性最强，对肺炎克雷伯菌的MIC明显低于金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌（P＜0.01，P＜0.05），且对肺炎克雷伯菌的MIC50（0.27mg／mL）和 MIC90（0.27～0.53mg／mL）均明显小于对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC50和 MIC90（表3）。

表3 肉豆蔻挥发油对不同种类细菌和真菌的抑菌活性比较（mg／mL）

3 讨论

肉豆蔻始载于唐《本草拾遗》，是一种传统中蒙药，兼有药用和香料价值。目前主要研究其挥发油的药理活性与化学成分，但由于提取方法与药材来源不同，挥发油的化学成分差异明显［2，9，16］。目前，关于其抑菌活性的研究报道较多，肉豆蔻水提物、甲醇提取物 、乙醇提取物和挥发油［8－11，15］以及肉豆蔻氯仿萃取物中分离的三肉豆蔻酸甘油酯、肉豆蔻酸、甘油十四酸酯［12］和肉豆蔻甲醇提取物中分离的肉豆蔻木酚素［4］均有一定程度的抑菌活性，但多数为定性分析，少有定量研究。本研究采用琼脂平板2倍稀释法定量测定了水蒸汽蒸馏提取的肉豆蔻挥发油对临床分离的4种革兰阳性菌和12种革兰阴性菌的MIC，结果表明肉豆蔻挥发油对所有受试菌有广谱抗细菌活性，MIC为0.07～8.50mg／mL，其中对表皮葡萄球菌的抑菌活性最强，MIC为0.07～0.13mg／mL；对铜绿假单胞菌的抑菌活性最差，MIC为4.25～8.50mg／mL，与郑国平等［14］报道“肉豆蔻精油对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和葡萄球菌的 MIC为2.5%～5%”的结果差异较大，分析原因可能是药材来源和所用抑菌试验方法不同。关于肉豆蔻挥发油的抗真菌活性研究报道较少，谢小梅等［13］报道，肉豆蔻水提液对霉菌无抑菌活性，而肉豆蔻挥发油对桔青霉、黑曲霉、黄曲霉、产黄青霉、黑根霉的 MIC和最低杀菌浓度（MFC）分别为 0.007% ～0.125% 和 0.031% ～0.125%；郑国平等［14］报道，肉豆蔻挥发油对根霉和青霉的MIC均为10%；肉豆蔻甲醇提取物中分离的肉豆蔻木酚素具有明显抗植物病原真菌活性［15］。对于肉豆蔻挥发油抗白假丝酵母菌真菌活性，目前尚未见有报道。白假丝酵母菌可侵犯人体许多部位，是人体重要的条件致病性真菌之一，可引起皮肤、黏膜、内脏及中枢神经的念珠菌病。本实验首次分析了肉豆蔻挥发油对白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌临床分离株的抑菌活性，结果表明，肉豆蔻挥发油具有较强的抗真菌活性，其中对白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌 MIC分别为0.07～0.53mg／mL和0.07mg／mL，说明可用于真菌与细菌所导致的各类感染性疾病。

本研究首次用单因素方差分析比较肉豆蔻挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、洛菲不动杆菌和白假丝酵母菌的抑菌活性。统计结果显示，肉豆蔻挥发油对白假丝酵母菌的抑菌活性［MIC（0.28±0.19）mg／mL］明显强于对大肠埃希菌［MIC（0.79±0.32）mg／mL］和金黄色葡萄球菌［MIC为（0.63±0.28）mg／mL］的抑菌活性（P＜0.01），而与对肺炎克雷伯菌和洛菲不动杆菌的抑菌活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。通过分析其对不同种类细菌的抑菌活性发现，肉豆蔻挥发油仅对肺炎克雷伯菌的抑菌活性明显强于金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌（P＜0.05，P＜0.01），对其它各菌种的抑菌活性与金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

本研究在受试细菌中既选择了敏感临床株和标准株，又选择了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产氨苄青酶和超广谱β－内酰胺酶的大肠埃希菌等多重耐药临床株和标准株。比较肉豆蔻挥发油对敏感株和耐药株的抗细菌和抗真菌活性，发现肉豆蔻挥发油对敏感株和耐药株的抗细菌和抗真菌活性无明显差异，说明肉豆蔻挥发油较化学合成药物治疗感染性疾病优势明显。

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