新芩梅颗粒的制备及药效学研究

尤本明，马 天，潘勇华，李 斌，刘继勇＊

（1.第二军医大学长海医院药学部，上海200433；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院皮肤科，上海200437）

［本文编辑］兰 芬

芩梅颗粒是第二军医大学长海医院用于治疗银屑病的特色自制制剂，由黄芩、青黛、当归、黄芪、乌梅5味中药材组成，具有清热解毒、益气活血的功效，临床主要用于治疗寻常型和脓疱型银屑病，疗效确切，安全性好，且价格低廉，服用方便，深受病人欢迎。但该制剂存在服用剂量大（20g／次，tid）、含糖量高、不适用于糖尿病病人等缺点。本研究在保持剂型不变的基础上，改进了芩梅颗粒的提取和制剂工艺，将提取物稠膏减压干燥得到干浸膏，采用一步制粒工艺制粒，减少糊精和糖粉等辅料的用量，降低了颗粒的口服剂量和含糖量，制备得到新芩梅颗粒，并对其药效学进行考察。

1 仪器和试药

1.1 仪器 流化床包衣制粒机（深圳信谊特科技有限公司）；倒置电子显微镜（日本奥林巴斯公司）；JH－2102型电子天平（上海精密仪器有限公司）；FA－2004万分之一电子天平（上海天平仪器厂）；DL－180A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；FSH－2高速匀浆机（武汉格莱莫检测设备有限公司）；5804R台式高速大容量离心机（德国艾本德公司）。

1.2 药品和试剂 黄芩（批号LY2012040237，上海雷允上中药饮片厂）；青黛（批号XD11072101）、乌梅（批号DH2012020201，上海信德中药公司饮片厂）；当归（批号DH2012032702，上海德华国药制品有限公司）；黄芪（批号YT2012050211，上海余天成中药饮片有限公司）；己烯雌酚注射液（大连美仑生物技术有限公司）；秋水仙碱、白凡士林（上海国药集团化学试剂有限公司）；消银颗粒（陕西康惠制药股份有限公司）；咪喹莫特乳膏（扬子江药业集团有限公司）；硝酸还原酶法一氧化氮（NO）测定试剂盒、硫代巴比妥酸法丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物医学研究所）；乙醇（常州杨园化工有限公司）；蛋白糖（郑州鸿祥化工产品有限公司）；羟丙甲纤维素（杭州崇科化工有限公司）。

1.3 动物 C57小鼠，SPF级，雌雄各半，体重18～20g；昆明种小鼠，SPF级，雌性，体重20～22g；Balb／c小鼠，SPF级，雌雄各半，体重18～20g［上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2007－0005］。

2 方法和结果

2.1 处方药材的提取 称取黄芩、当归、黄芪、乌梅药材各3kg，青黛药材1.5kg，置多功能提取罐中，加入8倍量的水煎煮1.5h，煎煮两次，滤过后合并提取液，减压浓缩至稠膏相对密度为1.18（60℃测定）［1］。加入适量95%乙醇，调节溶液乙醇浓度至70%，4℃静置24h。过滤，用旋转蒸发仪回收乙醇后，醇沉液置蒸发锅中浓缩成流浸膏，然后将流浸膏置60℃烘箱中干燥得干浸膏。干浸膏粉碎后过100目筛备用。

2.2 新芩梅颗粒的制备 采用一步制粒工艺制备新芩梅颗粒。取1kg干浸膏粉加入100g蛋白糖作为矫味剂，将细粉置于一步制粒机底部，设定风机转速为1700r／min，进风温度70℃，物料温度38℃，以5%羟丙甲纤维素（HPMC，E5）作为黏合剂，雾化器压力0.1MPa，喷入流化室制粒。制粒过程中设定黏合剂蠕动泵的梯度进料速度为4→6→8r／min。制粒结束后关闭雾化器，继续通入50℃热风干燥1h，将制得的颗粒过20～60目筛收集合格颗粒，计算成品率。成品率＝（合格颗粒重量／全部颗粒重量）×100%。计算得到颗粒成品率为72%。采用铝塑复合膜进行包装，即得新芩梅颗粒成品，每袋4g，相当于13.5g生药。

2.3 对小鼠尾部鳞片表皮颗粒层的形成影响 根据C57小鼠尾部鳞片表皮缺乏颗粒层的特性，模拟银屑病角化不全的特征，考察新芩梅颗粒促进表皮颗粒层生成的作用。取50只C57小鼠，雌雄各半，用随机数字表法分为5组，空白对照组，新芩梅颗粒低、中、高剂量组（0.1、0.2、0.4g·kg－1·d－1），阳性对照组（消银颗粒0.175g·kg－1·d－1，用生理盐水配制），灌胃给药，0.2ml／次，bid。空白对照组给予等体积的生理盐水。连续给药14d，最后一次给药后2h，将小鼠脱颈椎处死。取距尾根部2cm处背面皮肤一长条，用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色，在倒置显微镜下观察鼠尾鳞片表皮颗粒层生成情况［2，3］。颗粒层细胞位于棘细胞层和透明层之间，呈梭形，胞浆内有较多粗大的嗜碱性角质透明颗粒。凡是一个鳞片有连接成行的颗粒层细胞，称为有颗粒层的鳞片。计数连续100个鳞片中有颗粒层的鳞片数，结果见表1。观察得知，空白对照组小鼠尾部鳞片缺乏或仅少量有颗粒层细胞，并且颗粒层细胞排列疏松；中、高剂量治疗组和阳性对照组小鼠尾部鳞片颗粒层细胞排列紧密，有颗粒层的鳞片数目明显增加，部分连接成行。低、中、高剂量治疗组和阳性对照组均与空白对照组有显著差异，表明新芩梅颗粒能够促进小鼠尾部鳞片表皮颗粒层的形成，作用随剂量的增大而增强，中、高剂量新芩梅颗粒的作用与消银颗粒相当。

表1 新芩梅颗粒对小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成的影响Table 1 The effect of Xinqinmei granules on formation of granular layer in mouse tail scale epidermis（n＝10，）

表1 新芩梅颗粒对小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成的影响Table 1 The effect of Xinqinmei granules on formation of granular layer in mouse tail scale epidermis（n＝10，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，与空白对照组比较

0 21.7±6.3低剂量治疗组 0.1 38.6±8.1＊中剂量治疗组 0.2 48.5±7.3＊＊高剂量治疗组 0.4 52.8±9.3＊＊阳性对照组 0.175 51.7±8.9鳞片数空白对照组组别 剂量（g·kg－1·d－1） 有颗粒层的＊＊

2.4 对动情期小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响 60只雌性昆明种小鼠以随机数字表法分为6组，每组10只，分别为空白对照组，模型对照组，低、中、高剂量治疗组（新芩梅颗粒0.1、0.2、0.4g·kg－1·d－1），阳性对照组（消银颗粒0.175g·kg－1·d－1）。除空白对照组以外的小鼠腹腔注射己烯雌酚注射液，0.2mg／次，qd，连续注射3d，诱导小鼠处于动情期。从第4天开始灌胃给药，0.2ml／次，bid，连续给药14d。空白对照组和模型对照组小鼠给予等体积的生理盐水。为了避免细胞有丝分裂受日夜节律的影响，最后一次给药时间统一为上午8时。上午9时每只小鼠腹腔注射秋水仙碱2mg／kg，使有丝分裂停止于M期而便于计数［2，3］。下午2时脱颈处死全部小鼠，取阴道组织，用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色。在倒置电子显微镜下逐一观察每只小鼠的阴道上皮，计数300个基底细胞中发生有丝分裂的细胞数，以每100个基底细胞中发生有丝分裂的细胞数作为有丝分裂指数，结果见表2。观察可见，有丝分裂细胞主要分布在基底层，高剂量治疗组有丝分裂指数低，中剂量治疗组和阳性对照组相当，模型对照组的有丝分裂指数最高。表明新芩梅颗粒能够抑制动情期小鼠阴道上皮细胞有丝分裂，并呈现明显的量效关系。

表2 新芩梅颗粒对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂指数和背部银屑病样皮损的影响Table 2 The effects of Xinqinmei granules on mitosis index of vaginal epithelia cells and psoriasiform skin injuries on the back of mice（n＝10，）

表2 新芩梅颗粒对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂指数和背部银屑病样皮损的影响Table 2 The effects of Xinqinmei granules on mitosis index of vaginal epithelia cells and psoriasiform skin injuries on the back of mice（n＝10，）

＊＊P＜0.01，与空白对照组比较；△P＜0.05，△△P＜0.01，与模型对照组比较

组别剂量（g·kg－1·d－1）有丝分裂指数一氧化氮（μmol·g－1）丙二醛（μmol·g－1）空白对照组 0 3.42±1.02 2.45±0.37＊＊低剂量治疗组 0.1 2.44±0.81 0.82±0.16模型对照组 0 5.68±1.24＊＊0.79±0.29 2.75±0.83＊＊1.72±0.38△中剂量治疗组 0.2 2.12±0.63△2.02±0.42 1.51±0.11△△高剂量治疗组 0.4 1.94±0.46△△1.73±0.27△△1.46±0.20△△阳性对照组 0.1752.06±0.68△1.48±0.44△△1.42±0.35△△1.52±0.27△△

2.5 对小鼠背部银屑病样皮损的影响 取60只Balb／c小鼠，雌雄各半，分组情况同2.4项。将小鼠背部约2cm×1cm皮肤脱毛。空白对照组在脱毛处涂抹白凡士林，其余各组小鼠均涂抹咪喹莫特乳膏造模，涂抹厚度1.0mm，qd，连续6d，给药面积＞1cm×1cm，给药后发生斑片状脱毛反应提示造模成功。次日开始灌胃给药，0.2ml／次，bid，空白对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水，连续给药4周，每周观察并记录小鼠一般情况和局部皮损［4］。4周后手术切取各组小鼠背部皮肤，用预冷至4℃的生理盐水冲洗，除去残留的皮下组织和血管等杂质，拭干。切取0.5g皮肤，放入盛有2ml预冷至4℃生理盐水的小试管内，用高速匀浆机1×104r／min匀浆两次，每次10s，匀浆后 以68.48×g离心15min，取上清液－80℃冷藏。采用试剂盒测定其中NO和MDA的含量，结果见表2。小鼠造模成功后出现精神差、反应迟钝、进食减少等症状，背部皮肤粗糙，毛发脱落明显，有红斑脱屑，部分可见出血点。给药4周后，模型对照组皮损红斑略有减轻；治疗组和阳性对照组小鼠皮损症状明显改善，红斑鳞屑减轻，表明新芩梅颗粒可以改善银屑病的皮损红斑症状，减少皮损部位炎症因子NO和MDA的生成，与消银颗粒效果相当。

3 讨 论

银屑病是一种久治难愈且易反复发作的皮肤疾病，其临床表现为全身红斑和大量鳞屑，给病人生理和心理造成极大伤害，严重影响病人及家属的生活质量。目前对于银屑病的治疗多采用口服药物、补骨脂素加紫外线照射光化学（psoralen ultraviolet A，PUVA）治疗等综合疗法，但均存在较大问题。口服药物如维A酸类、糖皮质激素类或抑制表皮细胞分裂的药物，如甲氨蝶呤均具有较大的肝、肾毒性及其他副作用，停药后极易复发。外用药如芥子气、煤焦油类、地蒽酚及卡泊三醇等均为强细胞毒性药物，对正常皮肤细胞具有极强的腐蚀作用，使用不当极易对人体造成伤害。并且随着对毒剂管理的加强，这类药物的原料来源也越来越困难［5，6］。新的抗体类生物制剂，如依那西普、英利昔单抗等也开始应用于某些重症银屑病的治疗，但这类药物的适应证严格，对病人自身条件要求高，且生物制剂的长期不良反应还有待进一步明确，其价格昂贵，也限制了在临床的广泛应用［7］。

银屑病的组织病理学主要表现为角质形成细胞的过度增生、炎症细胞聚集和真皮乳头部血管增生扩张三大特征，从而导致角化过度、角化不全、颗粒层消失、棘细胞层增厚等症状。在研究中常利用小鼠尾部鳞片表皮角化，缺少颗粒层形成的过程，模拟银屑病表皮分化不全的特点；利用动情期小鼠阴道上皮细胞增生活跃的特点，模拟银屑病表皮增生过快的特点。咪喹莫特是Toll样受体激动剂，主要通过活化先天性免疫系统和诱导多种细胞因子来增强细胞免疫，刺激机体发生免疫应答［8］。本研究参照文献［4］，将咪喹莫特外用于小鼠皮肤构建银屑病样皮损变化。药效学研究表明，新芩梅颗粒能够显著促进小鼠尾部鳞片表皮颗粒层的形成，明显抑制小鼠阴道上皮细胞有丝分裂，减轻银屑病样皮损红斑症状，并可以抑制皮损部位炎症因子NO和MDA的生成。上述药效学的具体作用机制，将在后续研究中进一步探讨。本研究对苓梅颗粒的提取和制剂工艺进行了改进，采用一步制粒工艺制备得到新芩梅颗粒，使给药剂量由原来的20g／次降低到4g／次，且用蛋白糖替代原处方中的糖粉和糊精作为矫味剂，避免了原处方中糖分含量过大的缺点，扩大了该制剂的应用范围。

［1］杨帝顺，虞慧华，刘继勇.正交试验法优选芩梅颗粒的提取工艺［J］.中成药，2013，35（11）：2538－2540.Yang DiShun，Yu HuiHua，Liu JiYong.Optimization of the extraction technology of Qinmei granules by orthogonal test［J］.Chin Tradit Patent Med，2013，35（11）：2538－2540.In Chinese.

［2］王 萍，聂继红，孙玉华.双黄解毒乳膏对银屑病动物模型作用的实验研究［J］.中成药，2011，33（7）：1227－1229.Wang Ping，Nie JiHong，Sun YuHua.Experimental study on effects of Shuanghuangjiedu cream on the animal model of psoriasis［J］.Chin Tradit Patent Med，2011，33（7）：1227－1229.In Chinese.

［3］刘 靖，储开宇，查旭山.银屑1号对银屑病样动物模型细胞因子网络的调控作用［J］.新中医，2011，43（4）：110－112.Liu Jing，Chu KaiYu，Zha XuShan.Effect of Chinese medicineNo.1prescription for psoriasis on the cytokine network in the animal model of psoriasis［J］.J New Chin Med，2011，43（4）：110－112.In Chinese.

［4］van der Fits L，Mourits S，Voerman J S A，etal.Imiquimod－induced psoriasis－like skin inflammation in mice is mediatedviathe IL－23／IL－17axis［J］.J Immunol，2009，182（9）：5836－5845.

［5］杨雪琴.银屑病的合理治疗（上）［J］.中国临床医生，2011，39（3）：34－38.Yang XueQin.Rational treatment of psoriasis（part one）［J］.Chin J Clin，2011，39（3）：34－38.In Chinese.

［6］郑志忠.银屑病的治疗［J］.皮肤病与性病，2010，32（3）：8－9.Zheng ZhiZhong.The treatment of psoriasis［J］.J Dermatol Venereol，2010，32（3）：8－9.In Chinese.

［7］李 红，周澜华.银屑病的生物治疗新进展［J］.中国皮肤性病学杂志，2010，24（9）：862－864.Li Hong，Zhou LanHua.The progress of biologic therapies in the treatment of psoriasis［J］.Chin J Dermatovenereol，2010，24（9）：862－864.In Chinese with English abstract.

［8］Valins W，Amini S，Berman B.The expression of Toll－like receptors in dermatological diseases and the therapeutic effect of current and newer topical Toll－like receptor modulator［J］.J Clin Aesthet Dermatol，2010，3（9）：20－29.