单羧酸转运蛋白1、2在乳腺浸润性导管癌中的表达变化及其与病理级别之间的关系

李 倩 何笑冬 舒小镭 文 军 李少林 (重庆医科大学，重庆 0000)

乳腺癌是世界范围内危害女性人群健康最常见的恶性肿瘤之一〔1，2〕。浸润性导管癌(IDC)是一种最常见的乳腺癌，80%的乳腺癌都是IDC。单羧酸转运蛋白家族(MCTs)是位于细胞膜上担负乳酸等单羧酸及H+跨膜转运的通道蛋白。除转运单羧酸外，MTSs家族成员在催化糖酵解产物乳酸等单羧酸的转运及细胞内pH值的调节方面发挥重要作用。迄今为止，对MCTs基因家族成员研究较为深入的是 MCT 1及 MCT 2。前者主要参与乳酸的跨膜转运〔3〕，而后者则主要参与丙酮酸的跨膜转运〔4〕。研究表明，实体肿瘤细胞以无氧糖酵解作为获取能量的主要方式，这种代谢特点势必导致肿瘤细胞内乳酸等大量酸性物质生成增多，引起细胞内环境的酸化〔5〕。资料显示，MCT 1，MCT 2和MCT 4蛋白在乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢肿瘤中均有高表达〔6〕，然而有关MCT 1、2在乳腺IDC的表达变化及其病理级别的关系却鲜有报道。本研究拟观察MCT 1和MCT 2在人不同级别乳腺IDC中的表达变化，探讨乳腺IDC增殖、生长的分子机制。

1 材料和方法

1.1 病例及标本采集 随机选择2013年5～8月在重庆市肿瘤医院住院手术治疗的IDC患者37例。分为IDCⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级组;将癌旁相对正常组织为对照组。将收集到的乳腺癌Ⅰ～Ⅲ级的手术标本及癌旁正常组织部分进行石蜡包埋、切片，部分提取蛋白，置于-80℃冰箱备用。经过查询患者病史及病理检验证实，所有患者术前均未接受免疫治疗和放疗、化疗等。对照组的标本处理方法同前。

1.2 主要试剂 多克隆山羊抗人MCT 1、多克隆兔抗人MCT 2和单克隆小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，Santa Cruz公司);辣根酶标记的山羊抗兔IgG、辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记的鼠抗山羊IgG、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、二抗试剂盒(Dako公司)。

1.3 免疫组织化学显色 将所取相对正常乳腺组织与各级乳腺IDC的组织常规固定后，按照程序进行石蜡包埋，连续切片，厚度为4 μm。常规脱蜡后行苏木素-伊江(HE)染色，进行病理诊断和分级后，选片进行两步法免疫组织化学显色，MCT 1一抗浓度为1∶200，MCT2一抗浓度为1∶200，DAB 显色，HE 复染细胞核，磷酸盐缓冲液(PBS)终止显色，脱水透明后封片，显微镜观察并照相。阴性对照用0.01 mol/L的PBS代替一抗，其余步骤不变。采用北航(CM-2000B)生物医学图像分析系统进行图像分析，测定免疫反应阳性细胞的积分光密度值。

1.4 Western印迹 用Western印迹和IP细胞裂解液(北京普利莱)提取对照组和各级乳腺浸润性细胞瘤组织样品总蛋白，十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶分离蛋白，通过湿转方式将蛋白转至硝酸纤维膜上，用Western印迹封闭液37℃封闭 1.5 h，分别加入 MCT 1(1 ∶300)、MCT 2(1 ∶300)、GAPDH(1∶500)一抗，4℃过夜孵育，PBS洗膜后分别加入相应二抗，37℃孵育2 h，PBS洗膜后DAB试剂盒显色。用Quantity one软件转换后测定灰度值，以GAPDH为内参对照。

1.5 病理诊断 按照WHO乳腺肿瘤病理学和遗传学分类(2003年)推荐应用经Elston和Ellis改良的Bloom-Richardson半定量组织学分级法进行乳腺IDC(非特殊性)的组织学分级。

1.6 统计学处理 采用SPSS17.0软件，计量资料以s表示，多组均数进行比较采用方差分析，两两比较采用LSD法。

2 结果

2.1 病理诊断 乳腺癌IDCⅠ级10例，Ⅱ级12例，Ⅲ级15例，见图1。

2.2 MCT 1、2的免疫组织化学 对照组和乳腺癌浸润性癌组织中均有MCT 1和MCT 2的表达。对照组中MCT 1和MCT 2在乳腺导管上皮细胞胞质内呈弱表达。而在浸润性导管癌组织，MCT 1和MCT 2主要表达在肿瘤细胞的胞质和胞核中，并随着肿瘤级别的升高，其表达量逐渐增强。图像分析结果显示，与对照组比较，MCT 1和MCT 2在乳腺癌浸润性癌组织的表达明显升高(P＜0.05);不仅如此，不同病理级别的乳腺IDC细胞中MCT 1和MCT 2的表达，也具有显著性差异(P＜0.05)。从平均光密度值来看，MCT1和MCT2的表达模式具有一定的差异。见图1，表1。

图1 乳腺浸润性导管癌病理分级和MCT1、MCT2在各肿瘤组及对照组中的表达(HE，×400)

表1 对照组和不同病理级别乳腺浸润性导管癌组织中MCT1和MCT2的IOD值(s)

表1 对照组和不同病理级别乳腺浸润性导管癌组织中MCT1和MCT2的IOD值(s)

与对照组比较:1)P＜0.05;与各组间比较:2)P＜0.05

MCT1 MCT2对照组组别 n 37 6.11±0.12 3.27±0.17Ⅰ级组 10 23.32±0.331)2) 22.57±0.141)2)Ⅱ级组 12 46.91±0.111)2) 30.33±0.201)2)Ⅲ级组 15 67.49±0.231)2) 51.25±0.211)2)

2.3 MCT 1、2的Western印迹检测 各肿瘤组织中均可见MCT 1和MCT 2条带，与对照组相比，MCT 1和MCT 2在肿瘤组织中表达增强(P＜0.05)，并随着肿瘤组织病理级别的升高，MCT 1、2表达增强(P＜0.05)，各肿瘤组织之间相比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

图2 人不同级别乳腺浸润性导管细胞瘤组织及对照组中MCT1、MCT2的蛋白表达

3 讨论

乳腺癌是高度异质性的肿瘤，其中IDC占绝大多数 ，与其他类型乳腺癌相比较，其具有更加复杂的肿瘤细胞生物学行为。我国华东地区乳腺癌的发生率和病死率高于中西部地区;与西方发达国家相比较，中国患者发病年龄提前约10～15年，并可能伴有生物学标志物的改变〔2，7〕。肿瘤细胞生长在相对缺氧的环境中，其能量代谢的特点是有氧糖酵解。在酵解过程中，肿瘤细胞在获取能量的同时，必将伴随乳酸、丙酮酸等酸性产物的大量堆积，导致细胞内pH下降，引起肿瘤细胞内的酸化和凋亡。而肿瘤细胞内pH的降低，可抑制肿瘤细胞内原癌基因的激活，增强肿瘤对多种理化因素和化疗药物的易感性，从而诱导细胞凋亡〔8，9〕。然而，有资料显示，肿瘤细胞内的pH值呈反向分布，即细胞内的pH值高于细胞外，相对于细胞外，细胞内更趋向于碱化〔10，11〕，而细胞内的碱化，与 MCTs表达异常有关。

MCTs是一类重要的跨膜转运载体，涉及多种生物学功能。MCTs单羧酸转运蛋白家族也叫SLC16基因家族，迄今已经发现了14种亚型，分别命名为MCT 1～9、MCT 11～14和T型氨基酸转运蛋白-1(TAT-1)，而MCT 8则被认为是甲状腺激素转运体。由于MCTs家族成员可介导糖酵解产物乳酸等单羧酸及H+的跨膜转运，因此MCTs对细胞内 pH值的调节方面发挥重要作用。资料显示〔12〕，MCT 1，2可将肿瘤细胞内的乳酸和H+以1∶1的方式转运到细胞外，升高细胞内的pH值，碱化细胞内环境，从而抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞的增殖和生长。在MCT家族的研究中，MCT 1，MCT 2是发现最早的两个亚型，因此对其的研究也相对较为深入。现已发现，MCT 1几乎存在于所有的组织细胞中，而MCT 2仅在几种组织中有表达，即使在与MCT 1一起表达的同一组织中其组织分布位置也与MCT 1不同，提示其可能有具有不同的功能。尽管目前对MCT 1，MCT 2在正常组织细胞中的分布与功能，特别是MCT 1的功能有了较深入的了解〔13，14〕，但对其在病理情况下，如缺氧、缺血、休克及肿瘤等病理性乳酸产生增高方面的相关研究报道却并不多见。

本研究结果提示，乳腺IDC中MCT 1、2的高表达，有利于无氧糖酵所产生的酸性物质的跨膜转运，减少其在细胞内的堆积，从而碱化乳腺癌细胞内环境，抑制乳腺癌细胞的凋亡，促进乳腺癌细胞的增殖和生长。因此，如能通过化疗药物或反义基因治疗抑制MCT的表达，促使肿瘤细胞内环境过度酸化而死亡，将不失为一种治疗乳腺癌的一条新思路。

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