RNA干扰沉默Survivin重组腺病毒质粒的构建

李日恒 胡曼辉 高 峰 张彩菊 张 瑞 朱 红 王建博 魏 丹 刘玉英 苏 叶 张爱民 安宇亮

程树杰 (河北大学附属医院普外科，河北 保定 071000)

Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAP)中最有特点的一员，分子量最小，凋亡抑制作用最强。其氨基端只有一个BIR结构域，内含的一些氨基酸残基Tip67、Pro33、Cys84发挥凋亡抑制作用;羧基末端由一个两性α螺旋构成，调节Survivin的定位分布。研究表明Survivin在人的胚胎、胸腺、生殖腺、甲状腺、神经干细胞、结肠上皮细胞等正常组织少量存在;在多种恶性肿瘤组织中高表达，在人类正常分化的组织中不表达〔1～4〕。RNA干扰技术(RNAi)通过双链RNA(dsRNA)在细胞内诱导其同源特异性mRNA表达受抑制，从而引起基因转录后沉默〔5〕。通过RNAi技术，可以抑制含有特定序列的基因表达。本实验目的是构建Survivin-siRNA重组腺病毒质粒，记默Survivin基因，抑制结直肠癌细胞。

1 材料与方法

1.1 材料 人胚肾293T细胞ATCC细胞(上海拜立生物科技有限公司)，培养基 DMEM、0.25%胰酶、PBS、无血清培养基(北京清大天一科技有限公司)，腺病毒载体系Adenovirus Dual Expression Kit(pBAsi-Hh1，pBAsi-HU6，pBAsi-Mu6)，转染试剂盒及回收试剂盒，BamH I、EcoR I，QDL2000 Quantitative DNA Marker等(大连宝生物工程有限公司)，琼脂糖、LB肉汤培养基、甘油、液氮、SOC、卡那霉素、CsCl、病毒裂解上清液矿物等(北京世纪奥利生物技术有限公司)。

仪器:恒温摇床(上海和呈仪器制造有限公司);分光光度计(上海光学仪器厂)、恒温水浴锅(上海百典仪器设备有限公司)、低温高速离心机(湖南湘立科技仪器有限公司)、孵箱(Thermo上海米力光国际贸易有限公司);-80℃冰箱(海尔，北京天地精仪科技有限公司);EP管、方瓶、96孔板、透析袋等(北京清大天一科技有限公司)

1.2 方法

1.2.1 载体的构建 靶向Survivin基因寡核苷酸的设计:参考Reynolds设计原则制定shRNA的设计策略，选择Survivin基因(基因序号为 NM_001168.2)，Survivin-shRNA的有效序列 :GGCTGGCTTCATCCACTGC(86～104)，上游引物序列:5'-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3';下游引物序列5'-TTATTCCCAT-GCGACGGTATC-3'，产物长度为186 bp，重组载体命名为pBAsisurvivin。设计长度为19 nt，寡核苷酸序列以正反向组合，中间添加含9个寡链核苷酸(TTCAAGAGA)的loop结构，使寡核苷酸形成发夹结构，两端分别带BamH I和EcoR I酶切位点，具体结构为BamH I酶切位点+正义链+发夹结构+反义链+终止信号TTTTTT+EcoR I酶切位点。合成靶序列的oligo DNA由大连宝生物技术有限公司合成。重组合成DNA序列:正义链: 5'-GATCCGGCTGGCTTCATCCACTGCTTCAAGAGAGCAGTGGATG-AAGCCAGCCTTTTTTG-3';反义链:5'-AATTCAAAAAAGGCTGGCTTCATCCACTGCTCTCTTGAAGCAGTGGATGAAGCCAGCCG-3'。阴性对照组为上述shRNA编码序列打乱顺序后编码的产物，利用NCBI数据库中BLaST检索所选序列，不与任何人类、小鼠基因序列同源。对照组合成的 DNA序列:正义链:5'-GATCCGAGCTTGCCTAGCGTCCTCTTCAAGAGAGAGGACGCTAGGCAAGCTCTTTTTTG-3';反义链:5'-AATTCAAAAAAGAGCTTGCCTAGCGTCCTCTCTCTTGAAGAGGACGCTAGGCAAGCTCG-3'。各序列均含有59个寡链氨基酸，由大连宝生物科技有限公司合成上述单链。将合成好的oligo DNA稀释到2 μg/ml，放到退火体系中混匀加热95℃10 min，室温静置1 h，将冷却产物稀释到 100 倍，-20℃储存备用〔6，7〕。1.2.2 Survivin shRNA重组腺病毒表达载体的构建 由BamH I和EcoR I酶切pBAsi-Hh1载体使其线性化，酶切反应体系包括纯化的1 μg/μl DNA 质粒 2 μl;10 缓冲液 5 μl;100 × BSA 1 μl;10 U/μl的 BamH I 1 μl;10 U/μl的 EcoR I 1 μl;加 H2O至50 μl。将上述混合的反应物置于37℃1.5 h，将酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，随后切胶;用凝胶纯化试剂盒进行分离纯化。将退火产物双链DNA与酶切线性化处理的pBAsi-Hh1载体片段连接，按质粒:目的基因线性片段=1∶5的比例进行反应，连接体系如下:0.1 μg/μl线性化载体 1 μl，100 ng/μl退火的双链 DNA 1 μl，T4 DNA 连接酶 1 μl，10 × T4 DNA 连接酶缓冲液1 μl，加 dd H2O 至20 μl，于20℃过夜反应。最后将连接产物转化到经氯化钙法制备的DH5α感受态细胞，涂布于LB培养基平板上，37℃培养过夜。1.2.3 PCR鉴定及测序挑选重组阳性克隆行PCR鉴定 挑取8个菌落克隆抽提质粒、扩增，抽提的质粒经紫外分光光度计测定A260/A280，检测质粒浓度和纯度。使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增，上游引物序列:5'-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3';下游引物序列为5'-TTATTCCCATGCGACGGTATC-3'，PCR 产物5 μl上样，2%琼脂糖凝胶电泳。挑选阳性克隆送DNA测序(大连宝生物工程有限公司)。

1.2.4 腺病毒重组体的包装提取 将腺病毒包装系统中三种质粒DNA，溶于除菌的TE中，用紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提取质粒DNA的D260/D280在1.8～2.0，用胰蛋白酶消化对数生长期的293ATCC细胞，向灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pBAsi-Hh1载体20 μg，pBAsi-HU6载体 15 μg，pBAsi-Mu6 载体10 μg)，将 DNA 与 Lipofectamine 2000混合液转移至293ATCC细胞的培养液中，收集转染后48 h的293T细胞上清液，4℃ 8 000 r/min离心10 min，除去细胞碎片，0.45 μm PVDF膜过滤，收集病毒置于-80℃低温冰箱中保存。

2 结果

2.1 酶切法鉴定Survivin-siRNA重组腺病毒质粒 用BamH I和EcoR I双酶切pBAsi-Hh1载体后线性化，与未经酶切载体比较，将线性化载体与DNA oligo连接，产物转化DH5α感受态细胞，挑选阳性重组克隆PCR鉴定，重组克隆PCR片段为59 bp，未插入的空载体PCR片段为78 bp(图1)，鉴定结果与预期相符，结果表明合成的survivin shRNA序列插入正确。

图1 重组载体酶切结果

2.2 测序 经BamH I和EcoR I酶切产物进行双酶切，将酶切产物送至大连宝生物工程有限公司，测序结果与设计的序列一致。证明重组质粒构建成功。见图2。

图2 重组腺病毒质粒pBAsi-Survivin测序结果

3 讨论

Survivin的表达和分布特异性使其成为肿瘤诊断与治疗的新靶点。张文渊等〔8〕检测Survivin在宫颈癌中高表达，且与宫颈癌的临床分期有关。Choi等〔9〕发现结直肠癌细胞中Survivin细胞核表达83.3%，并与结直肠癌的肝转移密切相关。Survivin在结直肠癌中高表达，与结直肠癌的分化和预后密切相关。逆转Survivin的表达能抑制肿瘤的生长。

RNA干扰是将靶基因序列同源的双链RNA导入细胞，与靶基因mRNA结合，可以特异性阻断体内某些特定基因的表达，促使靶基因mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因表达沉默的过程，特异性、稳定性、效率性和穿透性均较高，是唯一有可能进行长期基因沉默研究的方法，可直接用于癌症相关基因的沉默，以达到疾病治疗或预防的目的。RNA干扰研究使用的载体大多是质粒、逆转录病毒和脂质体等，这些载体携带的基因在细胞核内处于游离状态，不能整合到染色体上，无法实现长期稳定的表达，因而在应用上受到一定的限制。而本研究采用的腺病毒载体能整合入宿主染色体，外源基因能够长期稳定表达;宿主细胞免疫反应小，毒性小;能感染非分裂和分裂期细胞，具有巨大的应用潜力。本研究所采用的腺病毒载体系统由pBAsi-Hh1载体、pBAsi-HU6载体、pBAsi-Mu6载体三质粒组成，pBAsi-Hh1载体含有人类H1启动子，使用RNA PolymeraseⅢ类启动子，既可以直接作为质粒转染细胞瞬间表达siRNA，也可以将“启动子hairpin序列”切出后亚克隆至腺病毒载体，利用重组腺病毒载体进行siRNA的长期表达。而pBAsi-HU6载体，pBAsi-Mu6载体含有病毒包装所必须的元件。本研究针对人survivin编码区设计了一对shRNA，以复制缺陷型腺病毒作为载体，构建了特异性干扰survivin基因的腺病毒载体。与慢病毒载体和反转录病毒载体相比，腺病毒载体不转染入染色体，在增殖与非增殖细胞内均可感染，感染效率基本上能达到100%。经PCR及测序鉴定证实病毒载体构建成功，经包装产生的腺病毒具有较高滴度，为进一步探讨 survivin沉默在结直肠癌SW480细胞中的生物学行为提供了基础。

1 Yue ZJ，Carvalho A，Xu ZJ，et al.Deconstructing survivin:comprehensive genetic analysis of survivin function by conditional knockout in a vertebrate cell line〔J〕.J.Cell Biol，2008;183(2):279-96.

2 Wu SF，Zhang JW，Qian WY，et al.Altered expression of survivin，Fas and FasL contributed to cervical cancer development and metastasis〔J〕.European Rev Pharmacological Sci，2012;16:2044-50.

3 Hori M，Miki T，Okamoto M，et al.The detergent-soluble cytoplasmic pool of survivin suppresses anoikis and its expression is associated with metastatic disease of human colon cancer〔J〕.PLoS One，2013;8(2):e55710.

4 Wang YQ，Zhang HH，Liu CL，et al.Correlation between auto-antibodies to survivin and MUC1 variable number tandem repeats in colorectal cancer〔J〕.Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2012;13(11):5557-62.

5 蔡 明，王国斌，陶凯雄，等.Livin靶向siRNA对大肠癌细胞凋亡的诱导作用〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2010;17(12):890-93.

6 彭冬先，何援利，丘立文.shRNA转染对异位内膜细胞survivin基因的靶点抑制作用〔J〕.南方医科大学学报，2010;30(4):859-63.

7 赵留芳.RNAi介导5urv1vin抑制鼻咽癌CNE一2裸鼠移植瘤的实验研究〔D〕.2011，昆明医学院.

8 张文渊，黄筱纮，平金良，等.Survivin、Fas在宫颈癌中的表达及意义〔J〕.肿瘤学杂志，2013;19(8):605-9.

9 Choi J，Chang H.The expression of MAGE and SSX，and correlation of COX2，VEGF，and survivin in colorectal cancer〔J〕.Anticancer Research，2012;32:559-64.