益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠丝裂原和应激激活蛋白酶1表达的影响

胡亚男 刘爱东 公培刚 郭江燕 张家颖 尚晓玲 (长春中医药大学，吉林 长春 307)

中枢神经免疫性疾病多发性硬化症(MS)伴随髓鞘退化和轴突变性可导致永久性神经损伤，以益肾、解毒、通络立法的中药复方益肾达络饮对MS有较好的治疗效果〔1〕。前期研究显示益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病中致炎因子、P38、β淀粉样前体蛋白等均有一定影响〔2～4〕。本文应用髓鞘蛋白脂蛋白(PLP)免疫SJL小鼠，构建MS实验动物模型，探讨MS的发病机制及中药治疗与丝裂原和应激激活蛋白酶(MSK1)的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级8～12周龄的SJL/J雌性小鼠24只，体重18～20 g，由美国Jackson实验室提供，动物饲养在吉林大学实验动物中心。SJL/J小鼠在实验前清洁饮水，自由饮食。

1.2 实验药品与试剂来源 抗原PLP139-151(HSLGKWLGHPDKF)多肽购自北京赛百盛生物工程公司，纯度95%以上。百日咳杆菌购自北京生物制品研究所，完全福氏免疫佐剂购自美国sigma公司，醋酸泼尼松购自天津天药药业股份有限公司(批号1006042)。醋酸泼尼松经研钵粉碎后以双蒸水溶解，充分混匀，配成0.039%浓度。4℃保存，使用前混摇均匀。益肾达络饮(由熟地、鹿角胶、栀子、石菖蒲、生甘草等组成)饮片购自长春中医药大学附属医院药房，经常规方法煎煮后制成2 g生药/ml的水提物，分装灭菌后4℃保存备用。中药按每公斤体重20 g生药量给予小鼠灌胃。SB203580购自美国Sigma公司，用2%二甲基亚枫(DMSO)溶解成1 mmol/L的溶液。Anti-MSK1单抗、anti-CREB单抗购自Cell Signaling公司。辣根过氧化物酶标价二抗购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。RIPA蛋白裂解液(中)、预染蛋白分子量标准、ECL化学发光试剂盒购自Beyotime公司。PVDF膜为Bio-Rad公司产品。垂直蛋白电泳仪为北京六一仪器厂生产。半干电转仪为大连竞迈生物科技有限公司产品。

1.3 动物模型制备 用PLP139-151抗原免疫小鼠:将100μl PLP139-151 水溶液(含 PLP139-151 150 μg)与 100 μl完全福(氏)免疫佐剂(含结核杆菌H37RA 400 μg)混合，充分乳化制成油包水的抗原配剂。第1天给予SJL/J小鼠上腹部皮下注射0.2 ml的抗原配剂，第1天和第3天给予静脉注射0.1 ml(含0.6×106个百日咳杆菌)百日咳杆菌液。

1.4 动物分组及给药 实验小鼠随机分为正常组、模型组、激素组、中药组、中药+激素组、抑制剂组，每组4只。正常组不作任何处理，模型组造模后第7天开始每天给予生理盐水0.2 ml灌胃14 d，中药组造模后第7天开始每天按每公斤体重2 g生药量给予益肾达络饮0.2 ml灌胃14 d，激素组造模后第7天开始每天按每公斤体重0.078 mg药量给予0.2 ml醋酸泼尼松灌胃14 d;中药加激素组造模后第7天开始每天按每公斤体重2 g生药量及0.078 mg醋酸泼尼松给予混合溶液0.2 ml灌胃14 d;SB203580组按照5 mg/kg的药量腹腔注射 SB203580〔5〕，造模后第7天给药1次，此后1次/6 d，共给药3次。

1.5 神经功能评价 免疫后所有动物每天称体重并进行神经功能评价，动物发病程度的判断根据Kono等〔6〕提出的标准，发病后动物出现不同程度的神经功能缺损，可见动物尾部无力，尾部无力加肢体无力，肢体轻度麻痹，肢体严重麻痹，被动翻身后不能复原和濒死状态。

1.6 MSK1免疫蛋白质印迹法检测 取造模后22 d时间点小鼠脑标本，放入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂及蛋白磷酸酶抑制剂)中，使用电动匀浆器低温条件下匀浆，浆液离心后取上清即得到蛋白溶液。BCA蛋白浓度分析试剂盒测定蛋白浓度。酶标仪测定波长为A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。取一定量的蛋白样品进行SDS-PAGE后，将凝胶中的蛋白采用半干转移法转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉/TBS-T封闭。加入一抗(1∶1 000稀释)及二抗(1∶5 000稀释)，SmartChemiⅡ型ECL化学发光成像仪进行显影，应用Image J计算蛋白条带的灰度值。与内参做比值后进行分析(以Tubulin为内参)。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件处理。实验数据以s表示，进行正态性检验和方差齐性检验，经One-Way ANOVA进行方差齐性检验后，选用S-N-K进行多组比较。

2 结果

中药组、模型组CREB与其余各组相比均显著升高(P＜0.01)，中药加激素组高于正常组(P＜0.01)。中药组、激素组、中药加激素组、抑制剂组4组的CREB水平由高到低为:中药组＞激素组＞抑制剂组＞中药加激素组(两两比较P＜0.01)。正常组及中药加激素组CREB的水平均低于各组，这两组之间比较均没有明显差异(P＞0.05)。

检测脑组织中MSK1表达显示，正常组和中药组、激素组、抑制剂组均有显著性差异(均P＜0.01);模型组和激素组、抑制剂组有显著性差异(均 P＜0.01)，与中药组有差异(P＜0.05);中药组和激素组、抑制剂组有显著性差异(P＜0.01)，与模型组、中药加激素组有差异(P＜0.05)。见图1，图2。

图1 MSK1、CREB免疫蛋白印迹结果

图2 MSK1、CREB灰度值折线图

3 讨论

MS是一种累及中枢神经系统的自身免疫性疾病，临床表现为麻木、痉挛、瘫痪、语言障碍、智力障碍及精神症状等，严重影响患者的生存质量。北京中医药大学高颖教授的研究团队创立了以益肾、解毒、通络立法的中药复方益肾达络饮，对MS有较好的疗效〔1～4，7〕。EAE 的发病机制、病理特点与 MS极为相似，EAE小鼠是研究MS的经典动物模型〔5〕。以往研究表明EAE发病与P38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号转导通路密切相关〔1〕，MAPK信号转导通路中P38或ERK激酶通过级联磷酸化激活 MSK，MSK直接磷酸化的下游底物还包括CREB、NF-κB等转录因子以及多个非转录相关蛋白。MSK是一类核内丝/苏氨酸蛋白激酶，是MAPK通路的下游媒介分子，参与MAPK信号通路介导的下游基因转录调控和表观遗传学调控。因此，MSK广泛参与肿瘤转化、炎症反应、神经突触可塑性等生物学事件。MSK1作为CREB的上游激酶之一，可使CREB的Ser133的位点磷酸化而激活〔8〕，CREB激活对维持脑损伤后神经元的再生、存活及修复起重要作用〔9，10〕。

SB203580是一种常用的P38 MAPK抑制剂，可以通过细胞抑制P38 MAPK(p38 MAP kinase)，抑制后续MAPKAP Kinase-2和MAPKAP Kinase-3的激活。通过抑制P38MAPK，SB203580可以有效抑制一些炎症因子(如IL-1β、TNF-α)诱导的部分信号转导。在阻断P38MAPK信号通路向核内传递时，一定程度上可以阻止CREB的磷酸化。先前的研究〔7〕表明SB203580能够明显降低EAE小鼠的神经功能评分，益肾达络饮治疗EAE的机制与调节P38MAPK这一细胞信号转导通路密切相关。本研究结果提示中药和激素、抑制剂均影响MSK1的表达，EAE发病中激活P38 MAPK信号转导通路，中药、激素与抑制剂均有治疗作用;且呈p38MAPK信号通路下游因子MSK1表达与及其底物CREB表达呈相同态势，EAE小鼠核蛋白CREB表达随P38 MAPK信号转导通路激活而增加。

中枢神经损伤后引发的信号转导网络变化非常复杂，损伤后的修复并非由单一信号通路决定，而是多因素多通路错综变化的复杂过程。

1 Shang XL，Gao Y，Yin L，et al.Effects of Yishendaluo decoction on axonal degeneration，inflammatory reaction，and neurological function in a mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕.Neural Regen Res，2009;4(11):928-34.

2 尚晓玲，高 颖，尹 岭，等.益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎MCP-1的影响〔J〕.天津中医药，2006;23(5):404-7.

3 尚晓玲，高 颖，尹 岭，等.益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠ICAM-1的影响〔J〕.中医药临床杂志，2007;19(2):123-5.

4 尚晓玲，高 颖，尹 岭，等.益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎β淀粉样前体蛋白的影响〔J〕.中国中医基础医学杂志，2008;14(9):664-6.

5 Wei S，Benjamin J，Daniel BJ，et al.Drugs designed to inhibit human p38 mitogen-activated protein kinase activation treat toxoplasma gondii and encephalitozoon cuniculi infection〔J〕.Antimicrob Agents Chemother，2007;15(12):4324-8.

6 Kono DH，Urban JL，Horvath SJ.Two minor determinants of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice〔J〕.J Exp Med，1988;168(1):213-27.

7 高 颖，关东升，娄丽霞，等.益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎p38MAPK信号转导通路的影响〔J〕.中华中医药杂志，2011;26(2):267-70.

8 Schiller M，Böhm M，Dennler S，et al.Mitogen-and stress-activated protein kinase 1 is critical for interleukin-1-induced，CREB-mediated，cfos gene expression in keratinocytes〔J〕.Oncogene，2006;25(32):4449-57.

9 Lonze BE，Ginty DD.Function and regulation of CREB family transcription factors in the nervous system〔J〕.Neuron，2002;35(4):605-23.

10 Walton MR1，Dragunow I.Is CREB a key to neuronal survival〔J〕?Trends Neurosci，2000;(2):48-53.