碱性成纤维细胞生长因子对碱烧伤兔眼角膜新生血管的影响

郭立云，张洁莹，孙 恒，胡竹林，边 慧

（1昆明医科大学第四附属医院，昆明 650021;2昆明医科大学第二附属医院;3昆明医科大学）

角膜疾病是造成眼盲的第二大因素，占全部眼盲患者的三分之一。轻中度角膜盲可通过供体的健康角膜移植得以复明。而严重角膜盲，尤其是重度酸、碱、热烧伤等引起的眼睑或结膜囊功能异常，严重天疱疮、Stevens-Johnson综合征、多次角膜移植术失败伴植床严重新生血管化等角膜盲，因严重的排斥反应，手术复明率尚不足20%，常规角膜移植术的成功率几乎为零。人工角膜成为这类角膜疾病复明的最后希望。但对人工角膜移植而言，材料与人体组织的生物相容性是影响人工角膜植入成败的关键［1］。碱烧伤可诱导角膜产生新生血管［2］，但同时可产生严重的炎症反应;而碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能诱导角膜产生新生血管，并减少炎症反应［3，4］。因此，我们推测 bFGF 既能促进碱烧伤兔眼角膜新生血管形成，又能降低炎症反应。为此，2011年6月～2012年3月，我们进行了相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料 健康日本大耳白兔12只（编号1～12），雌雄不限，体质量2 kg左右，由昆明医学院动物科提供。0.4%盐酸奥布卡因滴眼液，日本参天制药株式会社;Olympus双目显微镜，日本奥林巴斯公司;bFGF注射液，美国 PeproTech公司;Leica CM1850冰冻切片机及冰冻切片，德国Leica公司。人工角膜为本课题组自制的2片夹持型人工角膜，前片为PMMA材料，后片为硅胶材料。

1.2 方法

1.2.1 动物模型及分组 ①随机选大耳白兔10只（兔1～10）双眼制备角膜碱烧伤模型。碱烧伤1周后，左眼球结膜下多点注射bFGF，右眼球结膜下多点注射生理盐水。②选大耳白兔2只（兔11～12）左眼制备角膜碱烧伤模型，右眼为正常对照眼。③兔9～12进行病理学观察。模型制备:配制浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液，蘸于直径为10 mm圆形滤纸片;将大耳白兔固定后，左眼用盐酸奥布卡因滴眼液局部麻醉，将蘸有氢氧化钠溶液的圆形滤纸片置于开睑的兔眼角膜中央15 s后，立即生理盐水冲洗结膜囊，红霉素眼膏和阿托品眼膏涂抹结膜囊。隔日换药，生理盐水冲洗结膜囊，红霉素眼膏和阿托品眼膏涂抹结膜囊。在碱烧伤1周后，随机选10只大耳白兔，每日对其左眼（实验组）球结膜下多点注射 bFGF 1 U（约 0.5 mL），1 次/d，连续 7 d［5］;对所有兔子右眼（对照组）球结膜下多点注射生理盐水作为对照。

1.2.2 角膜新生血管生长情况观察 兔眼角膜碱烧伤模型建立2个月后，随机观察兔1～8双眼角膜新生血管生长情况。应用图像分析系统将角膜分为300格，计数角膜红变的区域，并统计分析。

1.2.3 兔眼人工角膜的植入 兔眼碱烧伤后2个月左右，从兔1～10中随机选8只兔，双眼行人工角膜植入术，植入的人工角膜为我们自制的2片夹持型人工角膜，瘢痕血管化的兔眼角膜夹持在两片之间。植入后2个月内，仍然对兔眼进行球结膜下多点注射bFGF，方法同术前。2个月后停止注射。1周后利用裂隙灯观察疗效，即人工角膜生长情况、新生血管多少，以及有无角膜溶解、变薄或穿孔等现象。

1.2.4 角膜组织病理学观察 空气栓塞法处死兔9～12后，立即取出眼球，固定、脱水，冰冻切片后HE染色，观察角膜病理学变化。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件，计量资料以±s表示，比较采用配对t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 角膜新生血管生长情况 角膜碱烧伤2个月后，碱烧伤模型兔眼角膜平均红变格数为203.23个，明显多于正常对照兔眼角膜的168.65个（t=3.876，P＜0.01），即碱烧伤模型兔眼角膜新生血管形成量多于正常对照兔眼。见图1。

图1 角膜新生血管生长情况

2.2 人工角膜移植后角膜生长情况 人工角膜移植6个月，碱烧伤模型兔眼人工角膜生长情况良好，无一例角膜发生溶解、脱出等严重并发症。正常对照兔眼中有2例角膜发生溶解穿孔，人工角膜脱出。见图2。

图2 人工角膜移植后生长情况

2.3 角膜病理组织学改变 正常对照眼角膜薄厚均一，上皮、内皮完整，基质细胞排列有序（图3-1）;碱烧伤角膜上皮及内皮不完整，基质层细胞排列不规则可见紊乱的瘢痕组织，散在薄壁新生血管（图3-2～3-4）;角膜碱烧伤后联合注射bFGF眼角膜上皮、内皮完整，基质层细胞排列较规则，上皮下为排列紧密的基质瘢痕组织，较多薄壁新生血管（图3-5）。

图3 角膜碱烧伤及联合注射bFGF后角膜组织切片HE染色

3 讨论

人工角膜发展至今已有将近200年的历史，其在一定程度上可以帮助角膜盲患者复明，但人工角膜与角膜周围存有界面，不能紧密连接，故植床角膜及与异质材料接触的组织往往发生萎缩、坏死或组织溶解等退行性病理改变，甚至发生房水渗透、眼内感染及人工角膜脱落等并发症，极大地限制了其临床应用。为此，本实验对人工角膜及其受体植床的条件进行了探索，旨在为人工角膜应用于临床积累有益的理论基础。

以往我们的研究表明，本课题组自制的夹持型人工角膜移植后角膜溶解、穿孔是最常见的并发症，发生率约为20%。其原因多为因角膜营养不足，如角膜瘢痕化不够，对营养需求增加;移植前角膜血管化少，营养供应不足［6］。人工角膜移植术需要受体植床上新生血管足够多，故如何增加移植术前角膜新生血管，就成了人工角膜植入后长期存活的关键。目前，引起角膜新生血管的方法有多种，如角膜缝线法、角膜碱烧伤法、角膜囊袋法、角膜缘干细胞破坏法等，大多数方法会增加炎症反应，在导致角膜血管化的同时，引起角膜炎、角膜溃疡及严重的前房虹膜反应，增加玻璃体混浊和继发性青光眼的风险。而采用血管诱生剂在调节刺激新生血管生长的同时，不会增加炎症反应。

bFGF是Gospodarowicz在1974年从人脑中分离纯化出的一种多肽因子。bFGF在胚脑及成年脑中均有分泌，是一种强效的血管生长因子和血管内皮细胞有丝分裂原［7］;它能通过作用于细胞表面相应受体促进神经干细胞的增殖和分化［8］。其主要生物学作用还有促进创伤愈合与组织修复再生、参与神经再生等。国内外研究［9～11］表明，bFGF作为一种新生血管诱生剂，能局部刺激新生血管的产生;在组织缺血缺氧情况下，其作用更加明显［12～14］。我们在预实验中单独采用bFGF刺激新生血管的形成发现，新生血管维持时间较短，撤药后逐渐退化。所以本实验采用bFGF和碱烧伤联合应用诱导新生血管，bFGF只是在人工角膜植入前后使用，既增加和维持角膜新生血管，又减少了碱烧伤的强度，使角膜度过缺血缺氧的关键时期，大大减少了角膜因营养不足导致的溶解变薄和穿孔的发生，提高了人工角膜移植的整体成功率。

本实验建立了新的角膜新生血管造模方法。此法既能诱导角膜产生较多的新生血管，又能减少炎症反应，模型眼角膜病理切片证实了应用bFGF可促使角膜有效的瘢痕化;碱烧伤模型兔眼中无一例角膜发生溶解、脱出等严重并发症。说明该建模方法的有效性和可靠性;同时通过对照研究（角膜碱烧伤/角膜碱烧伤后联合注射bFGF）证实，bFGF对角膜碱烧伤有促进修复作用。以此为基础，我们可以进一步考察人工角膜能否有长时间移植的潜能，验证人工角膜替代治疗供体角膜的可能。

总之，本研究建立了一种新的角膜新生血管造模方法，这种造模方法能够模拟角膜病变后的病程和病理生理特征，并能保证人工角膜移植后的正常生长，为将来人工角膜移植的开展奠定了基础。

［1］迟玮，王滨生.新型人工角膜的研究［J］.眼外伤职业眼病杂志，2004，26（6）:429-430.

［2］韩旭光，吴欣怡，曲飞，等.角膜缝线与碱烧伤诱导兔角膜新生血管的实验观察［J］.山东大学耳鼻喉眼学报，2009，23（2）:79-82.

［3］胡永芳，吴勇杰，刘仲奇.碱性成纤维细胞生长因子与炎症的关系［J］.国外医药:抗生素分册，2000，21（6）:278-282.

［4］Loughnan MS，Chatzistefanou K，Gonzalez EM，et al.Experimental corneal neovascularisation using sucralfate and basic fibroblast growth factor［J］.Aust N Z J Ophthalmol，1996，24（3）:289-295.

［5］孙康，徐锦堂，陆强，等.人工角膜植入术后EGF和bFGF局部应用的实验研究［J］.眼外伤职业眼病杂志，2003，25（8）:512-514.

［6］李娜，周伟，杜红，等.PMMA-硅胶夹持型人工角膜植入碱烧伤兔眼的实验研究［J］.中华眼外伤职业眼病杂志，2011，33（8）:570-572.

［7］Zittermann SI，Issekutz AC.Basic fibroblast growth factor（bFGF，FGF-2）potentiates leukocyte recruitment to inflammation by enhancing endothelial adhesion molecule expression［J］.Am J Pathol，2006，168（3）:835-846.

［8］李群秀，刘学政，张克俭，等.视网膜细胞联合bFGF体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化［J］.中华眼视光学与视觉科学杂志，2010，12（2）:122-123.

［9］孙悦，张士胜，廖华萍，等.bFGF诱导兔眼视网膜下新生血管形成的实验研究［J］.眼科研究，2006，24（4）:359-363.

［10］Bossard C，Laurell H，Van den Berghe L，et al.Translokin is an intracellular mediator of FGF-2 trafficking［J］.Nat Cell Biol，2003，5（5）:433-439.

［11］Detillieux KA，Sheikh F，Kardami E，et al.Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium［J］.Cardiovasc Res，2003，57（1）:8-19.

［12］崔世军，张建，俞恒锡，等.VEGF及bFGF基因治疗家兔肢体缺血的实验研究［J］.北京医学，2007，29（8）:503-504.

［13］刘冰，王豪夫，刘兵，等.大鼠缺血后肢局部应用bFGF对血管新生的影响［J］.齐鲁医学杂志，2009，24（3）:271-273.

［14］袁春燕，赵颖，牛膺筠.碱性成纤维细胞生长因子与视网膜缺血再灌注损伤［J］.青岛大学医学院学报，2003，39（2）:216-217，220.