PPARγ受体在大鼠缺氧性肾小管上皮细胞损伤中的表达及意义

蒋 玲，李正一，周志强，陈秀萍，雷凤英，覃远汉

（广西医科大学第一附属医院，南宁 530021）

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）属于配体激活的核细胞受体超家族，为Ⅱ型核激素受体超家族成员，有 α、β、γ 三种亚型［1］。在肾脏内，PPARγ参与正常肾脏的发育、脂质代谢，具有调节水盐重吸收、调控肾血流量并激活肾素—血管紧张素系统等生理功能［2，3］。目前，在单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型中发现，PPARγ具有抗肾间质纤维化（RIF）作用［4］。然而PPARγ在体外培养的缺氧性肾小管上皮细胞（RTEC）中的表达及作用尚不清楚。2012年12月～2013年6月，为探讨PPARγ在缺氧性RTEC损伤中的作用，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠缺氧性RTEC细胞株（NRK-52E）购自上海细胞库;DMEM高糖培养基、超滤胎牛血清购自美国HyClone有限公司;罗格列酮（RGZ）、GW9662购自美国Sigma公司;二甲基亚砜购自索莱宝生物科技有限公司;其他均为常规仪器和试剂。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及分组 将NRK-52E于37℃、5%CO2条件下置入含5%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，待细胞生长至约80%融合时传代。待传代的细胞生长至对数期时，将细胞随机分为4组:正常对照组、缺氧模型组、RGZ组及GW9662组。正常对照组常规培养，不予缺氧性损伤处理。缺氧模型组、RGZ组及GW9662组行缺氧性损伤处理［5］，同时RGZ组给予15 μmol/L RGZ、GW9662组给予25 μmol/L GW9662处理。36 h后收集细胞行相关指标检测。

1.2.2 PPARγ、TGF-β1mRNA 表达检测 采用 RTPCR法。按照RNA提取试剂盒说明提取细胞总RNA，选取完整的mRNA，按反转录试剂盒要求进行反转录，β-actin为内参。PPARγ上游引物:5＇-GATGACCACTCCCATTCCTTT-3＇，下 游 引 物:5＇-CGCACTTTGGTATTCTTGGAG-3＇，片 段 长 度 156 bp。TGF-β1上 游 引 物:5＇-CGCAATCTATGACAAAACCAAA-3＇，下 游 引 物:5＇-TTCTACGTGTTGCTCCACAGTT-3＇，片段长度 154 bp。β-actin 上游引物:5＇-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3＇，下 游 引 物:5＇-CCCATACCCACCATCACACC-3＇，片段长度 207 bp。反应体系为20 μL:2.5 ×Real MasterMix/SYBR solution 9.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA 1 μL，超纯水9.2 μL。PCR 反应条件:PPARγ:95 ℃预变性 10 min，68 ℃变性15 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共进行40个循环;TGF-β1:95℃预变性10 min，68 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共进行40个循环。每样本重复3次。以正常对照组的基因表达量为 1，采用相对定量 2-ΔΔCT法［6］计算其余各组mRNA的相对表达量。变化倍数（Fold change）为缺氧模型组、RGZ组和GW9662组较正常对照组基因的相对表达倍数。

1.2.3 PPARγ、TGF-β1蛋白表达检测 采用Western blot法。按常规方法提取NRK-52E的总蛋白，二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。4℃、12 000 r/min离心后加入上样缓冲液，煮沸变性后行Western blot检测。以β-actin为内参，行10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）、封闭液室温封闭1 h、一抗4℃孵育过夜、二抗常温避光孵育1.5 h，最后扫描PVDF分析蛋白表达量。

1.2.4 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件，数据以±s表示，比较采用单因素方差分析q检验（SNK法）。相关性分析采用直线相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RTEC形态观察 正常对照组RTEC形状浑圆，细胞间隙清晰。缺氧模型组RTEC形状变尖锐，出现萎缩，细胞间隙变宽加深，且宽度不一，细胞壁出现塌陷。与缺氧模型组比较，RGZ组RTEC萎缩减轻，细胞间隙变窄，细胞壁塌陷程度较轻;GW9662组RTEC萎缩加重，细胞间隙变宽。

2.2 各组 RTEC PPARγ、TGF-β1mRNA 表达比较见表1。

表1 各组RTEC PPARγ、TGF-β1mRNA表达比较

2.3 各组 RTEC PPARγ、TGF-β1蛋白表达比较见表2。

表2 各组 RTEC PPARγ、TGF-β1蛋白表达比较（ ±s）

表2 各组 RTEC PPARγ、TGF-β1蛋白表达比较（ ±s）

注:与正常对照组比较，*P ＜0.05;与缺氧模型组比较，#P ＜0.05

组别 n PPARγ TGF-β1正常对照组9 5.13 ±0.15 3.48 ±0.06缺氧模型组 9 4.28 ±0.39* 5.32 ±0.07*RGZ 组 9 4.85 ±0.11*# 4.75 ±0.09*#GW9662 组 9 2.27 ±0.17*# 7.49 ±0.12*#

2.4 缺氧性 RTEC 损伤中 PPARγ、TGF-β1蛋白表达的关系 缺氧性RTEC中PPARγ的蛋白表达与TGF-β1的蛋白表达呈负相关（r=-0.91，P＜0.05）。

3 讨论

RTEC损伤是指肾小管受到缺氧、炎性因子、蛋白尿等因素作用后，RTEC活化、增殖，炎性因子分泌增加，并导致上皮细胞转分化（EMT）。而EMT是RIF的早期可逆性阶段，也是终末期肾病的主要病理改变［7］。目前认为，EMT导致的肾间质细胞成纤维化和细胞外基质沉积是RIF发生的中心环节和关键因素。因此认为，RTEC损伤与RIF的发生、发展密切相关［8］。

TGF-β1是目前发现的作用最强的致肾纤维化的细胞因子，具有刺激细胞外基质积聚、诱导产生下游致纤维化因子的作用，最终加剧RIF［9］。缺氧可导致上皮细胞中 TGF-β1和 α-平滑肌动蛋白（α-SMA）表达上调，出现Ⅳ型胶原纤维和纤维连接蛋白沉积。Matsuoka等［10］对胃癌细胞缺氧处理24 h后发现，胃癌细胞中 TGF-β1表达明显升高。Copple［11］对肝上皮细胞缺氧处理后发现，EMT相关基因（如成纤维细胞特异蛋白、α-SMA）表达升高。因此，TGF-β1可作为细胞缺氧性损伤的检测指标。本课题组前期研究发现，在UUO大鼠模型中，肾脏组织TGF-β1表达明显升高，梗阻时间越长，TGF-β1表达越高，肾脏损伤越严重［12］。本研究结果显示，缺氧模型组、RGZ组和GW9662组RTEC出现细胞萎缩，细胞壁塌陷，细胞间隙变宽，细胞损伤程度较正常对照组重;TGF-β1的蛋白表达量明显高于正常对照组，提示本研究模型制备成功。

PPARγ在脂肪组织、肝脏、肾脏、血管上皮等组织广泛分布并参与细胞的增殖、分化和凋亡。研究发现，PPARγ激动剂有保护肾脏及其细胞损伤的作用。如Lin等［13］报道，激动PPARγ可抑制高糖诱导的大麻素1受体高表达，减轻肾小球系膜炎症反应和纤维化;Wei等［14］研究发现，在 TGF-β1诱导的大鼠RTEC 转分化模型中，RGZ 可抑制 TGF-β1、α-SMA的表达，抑制转分化。这些均提示PPARγ信号通路参与抑制纤维化的过程。本研究结果显示，在缺氧性RTEC损伤中，PPARγ蛋白表达明显降低，TGF-β1蛋白表达明显升高，PPARγ的蛋白表达与TGF-β1的蛋白表达呈负相关，提示PPARγ蛋白的低表达可能参与了缺氧性RTEC损伤;在受体激动剂RGZ干预之后，RGZ组RTEC损伤较缺氧模型组明显减轻，PPARγ蛋白的表达水平较缺氧模型组明显增高，TGF-β1蛋白表达水平明显降低，提示RGZ可能通过上调PPARγ蛋白的表达起到减轻RTEC损伤的作用;GW9662是高选择性的PPARγ抑制剂，本研究GW9662组RTEC损伤较缺氧模型组明显加重，PPARγ蛋白的表达水平较缺氧模型组明显降低，TGF-β1蛋白的表达水平明显增高，提示GW9662可能通过下调PPARγ蛋白的表达而加重RTEC损伤。

综上所述，在缺氧性RTEC损伤中，PPARγ蛋白的低表达可能参与了RTEC损伤;RGZ可能通过上调PPARγ蛋白的表达而减轻RTEC损伤。

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