人视网膜母细胞瘤组织中的血管生成拟态观察及相关调控因子的作用

张丽娜，赵桂秋，林 红，王 谦，牛膺筠

(青岛大学医学院附属医院，山东青岛266003)

以往的肿瘤血管生成理论认为，肿瘤直径＞2 mm时需要激活血管内皮细胞构建血管丛、而获取血供，否则肿瘤会因缺血缺氧而发生坏死。但Maniotis等［1］在1999年提出，经典的“血管生成”可能不是所有肿瘤获得微循环血液供应的惟一途径，具有高侵袭性和转移性的恶性脉络膜黑色素瘤细胞可以模拟内皮细胞形成类似血管腔样的通道，过程类似胚胎期血管形成，并将其命名为“血管生成拟态”(VM)。目前，国内外学者已在多种恶性肿瘤及双向分化肿瘤组织中发现VM，并通过电镜、免疫组织化学及时相动态性核磁血管造影分析观察到VM与肿瘤血管之间的血流连接，证实VM是肿瘤组织内的功能性微循环［2～4］。2014年1月，我们对人视网膜母细胞瘤(RB)组织中的VM形成情况、来源及相关调控因子进行了检测，旨在为进一步认识RB的微循环模式提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 2007年1月～2013年12月青岛大学医学院附属医院眼科病理室存档的43份RB组织石蜡切片，其中未分化型25份、分化型18份，眼内期11份、青光眼期17份、眼外期15份;一抗包括鼠抗人CD34单克隆抗体、鼠抗人ATP结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)单克隆抗体、鼠抗人造血干细胞抗原CD133(AC133)单克隆抗体、鼠抗人缺氧诱导因子1α(HIF-1α)单克隆抗体、兔抗人EphA2多克隆抗体、兔抗人基质金属蛋白酶(MMP)-2多克隆抗体(Santa Cruz公司)，二抗包括辣根过氧化酶标记的羊抗鼠/兔二抗试剂盒(碧云天);DAB显色试剂盒(碧云天);过碘酸-Schiff染色试剂盒(碧云天);Olympus光学显微镜(日本Olympus公司);恒温水浴箱等。

1.2 RB组织中VM的检测方法

1.2.1 HE染色 将RB组织石蜡切片置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中脱蜡各5 min;梯度乙醇脱蜡，每步1 min;自来水洗1 min，蒸馏水浸泡30 s，1%苏木素染色5 min，自来水充分冲洗，1% 盐酸乙醇溶液分化脱色15 s;自来水充分冲洗，1%氨水返蓝30 s;自来水冲洗1 min，0.5%伊红染色 30s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.2 过碘酸-Schiff/CD34(PAS/CD34)双重染色将RB组织石蜡切片常规脱蜡至水，CD34免疫组织化学染色方法同上，至DAB显色，自来水充分冲洗为止;蒸馏水浸泡1 min，1%过碘酸溶液浸泡5～10 min，蒸馏水充分冲洗，Schiff液浸泡10～15 min，0.5%偏重亚硫酸钠溶液冲洗1～2 min×2次，蒸馏水冲洗10 min，苏木素轻度复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。以正常肾组织作为阳性对照。按照Folberg等［5］制定的PAS阳性模式标准评价双重染色结果。VM判断标准:无内皮细胞衬复，肿瘤细胞围成不规则管腔并衬复PAS阳性物质，CD34染色阴性，管腔内可见红细胞，周围无出血坏死和炎症细胞浸润。利用图像处理软件，随机选择10个高倍镜视野，连续计数视野内的VM，取其均值即为血管生成拟态密度(VMD)。

1.3 RB 组织中 ABCG2、AC133、CD34及 HIF-1α、E-phA2、MMP-2的检测 采用免疫组织化学染色法。将RB组织石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O2去离子水室温孵育5～10 min，PBS洗涤3 min×3次，微波抗原修复;正常山羊血清封闭液室温孵育20 min，倾去山羊血清封闭液;分别滴加鼠抗人CD34单克隆抗体(1∶200)、鼠抗人 ABCG2 单克隆抗体(1∶100)、鼠抗人AC133单克隆抗体(1∶100)、鼠抗人HIF-1α单克隆抗体(1∶200)、兔抗人 EphA2多克隆抗体(1∶300)、兔抗人 MMP-2 多克隆抗体(1∶300)，4 ℃湿盒过夜;PBS冲洗，3 min×3次;根据一抗分别滴加1∶500稀释的辣根酶标记的羊抗兔IgG或辣根酶标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育30 min;PBS冲洗，3 min×3次;DAB显色，苏木素轻度复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。用PBS代替一抗作为空白对照。ABCG2阳性为细胞膜呈黄色或棕黄色，AC133及CD34阳性为细胞质呈黄色或棕黄色;HIF-1α阳性为胞核呈黄色或棕黄色，EphA2与MMP-2阳性均为胞质呈黄色或棕黄色。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件。正态分布的计量资料以±s表示，行方差分析及q检验;数据为非正态分布者用中位数表示，两样本间比较行Mann-Whitney非参数检验。计数资料行χ2检验;VMD与相关因子的关系采用Pearson相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RB组织中VM检测结果 HE染色显示，部分RB组织中除有内皮细胞衬覆的血管外，还可见肿瘤细胞围成的不规则管腔，腔内有红细胞(图1A)。PAS染色见樱桃红色的阳性血管样图案(网状、分支状)，且阳性物质呈颗粒状或团块状散布在肿瘤细胞胞质内，可见单个肿瘤细胞或几个肿瘤细胞周围有一层PAS阳性物质环绕(图1B)。PAS/CD34双重染色可见两者染色均阳性的内皮细胞依赖性血管及PAS阳性、CD34阴性的VM(图1C)。43份RB组织中VM 阳性 23例(53.48%)，VMD 为(26.52±8.72)个/HP。其中分化型和未分化型组织的VM阳性率分别为 22.22%(4/18)、76%(19/25)，P ＜0.01(χ2=12.165);眼内期、青光眼期、眼外期组织的 VM 阳性率分别为 41.45%(6/11)、47.05%(8/17)、60%(9/15)，各期比较 P ＞0.05(χ2=0.543)。Pearson相关性分析显示，VM阳性率与RB的分化程度呈负相关(r=-0.532，P ＜0.05)，与临床分期无明显相关。

图1 三种染色方法所示VM(×100)

2.2 RB组织中ABCG2、AC133及CD34表达 VM阳性RB组织中可见部分肿瘤细胞ABCG2阳性表达，VM阴性组织中则少见ABCG2阳性表达，两组织中ABCG2阳性细胞数分别为为(20.91±9.90)、(2.85±2.64)个/HP(阳性细胞多分布在内皮依赖性血管或拟态血管周围)，Mann-Whitney非参数检验显示，U=-5.538，P ＜0.01。在作为对照的正常视网膜组织中，CD34在血管内皮细胞中表达阳性，AC133未见表达;VM阳性组织中部分肿瘤细胞AC133表达阳性(图2B)，VM阴性组织中未见AC133表达;所有RB组织中仅血管内皮细胞CD34阳性表达(图2C)。

图2 免疫组织化学染色(×200)所示ABCG2、AC133及CD34表达

2.3 RB 组织中 HIF-1α、EphA2、MMP-2 的表达及与VMD的相关性 HIF-1α、EphA2、MMP-2在 VM阳性组织中的表达分别为 58.12 ±6.79、108.49 ±8.54、93.93 ±6.19，在 VM 阴性组织中分别为 8.95±3.76、43.94 ±5.44、22.13 ±5.48，两两比较，P 均＜0.01(t分别为 28.70、29.01、39.95)。Pearson 相关性分析显示，VMD与HIF-1α、EphA2及MMP-2表达均呈正相关(r分别为 0.694、0.630、0.795，P 均＜0.01)。

3 讨论

VM是指某些高度恶性肿瘤细胞通过自身变形模拟血管内皮细胞并与细胞外基质相互作用模仿血管壁结构形成可以运输血液(血浆，红细胞)的管道系统，进而重塑肿瘤微循环，并与宿主血管相连使肿瘤获得血液供应的一种现象［1］。VM概念的提出是对传统“内皮依赖性血管是肿瘤微循环的惟一方式”这一观点的挑战，也是肿瘤血管生成及血液供应理论的重要补充，并将对肿瘤的预防、诊断和治疗策略产生重大影响。目前，VM的生成机制尚不明确，其与内皮依赖性血管的本质区别为无内皮细胞的衬覆［5］，仅是肿瘤细胞围成的管腔。在VM形成过程中，部分肿瘤细胞要通过自身变形并模拟内皮细胞的功能成为有运输能力的管道;由于缺乏内皮细胞，VM管壁上的肿瘤细胞容易脱落入其管道中，进入血管向远处转移。因此，VM与肿瘤的高度侵袭性和不良预后有明显相关性;VM仅在低分化的恶性肿瘤中存在，说明肿瘤细胞的这种变形及表现内皮细胞特性的能力与其分化程度有关。本研究结果显示，23例RB组织发现VM存在，其中未分化型组织阳性率显著高于分化型组织，而不同临床分期组织间比较阳性率无显著差异。提示VM主要在低分化的 RB中存在，而与肿瘤的分期无明显相关性［6，7］。

肿瘤细胞出现多潜能胚胎细胞表型和多种与内皮/血管表型有关的基因表型可能是其发生模拟血管变形的重要分子基础。目前认为，构成VM管壁的肿瘤细胞来源于肿瘤中具有多向分化潜能的干细胞，这些肿瘤干细胞向内皮细胞方向分化是形成VM的基础。Elena等［8］认为，肿瘤的血管化包括新生血管形成、recruitment、VM、马赛克血管等多种模式，其原因可能是肿瘤中存在干细胞亚群。ABCG2是ATP结合转运体超家族中的G2家族成员，最早发现在造血干细胞中高表达，目前已被当作最常用的肿瘤干细胞表面标志物［9］。本研究发现，VM阳性RB组织中ABCG2阳性细胞数显著多于VM阴性组织，且阳性细胞多分布在内皮依赖性血管或拟态血管周围。提示ABCG2阳性的肿瘤干细胞在VM形成中可能扮演重要角色，并可能是构成VM管壁的主要细胞来源。肿瘤细胞可表达其他类型细胞的特异性基因(尤其是内皮细胞特异性基因)，此可能为其通过自身变形模拟内皮细胞形成PAS阳性管道状结构能力的机制之一［10］。AC133是内皮祖细胞及前体细胞的特异表达基因，在成熟内皮细胞中不表达;CD34则相反，是一种分化成熟的内皮细胞特异性标志［11］。本研究显示，VM阳性RB组织中可见部分肿瘤细胞AC133阳性表达，未见CD34表达;而肿瘤组织中血管内皮细胞未见AC133表达，CD34表达阳性。提示构成VM管壁的内皮样肿瘤细胞更有可能是来源于肿瘤干细胞。CD34在肿瘤细胞中的表达尚无统一意见。目前鉴定VM最常用的办法是PAS/CD34双重染色，CD34染色阳性的血管通常被认定为内皮依赖性血管，而构成VM的肿瘤细胞CD34表达阴性［12］;亦有学者发现构成VM的肿瘤细胞可表达CD34［13］。本研究未发现表达CD34的肿瘤细胞的可能原因为肿瘤干细胞逐渐向内皮样细胞分化的过程类似胚胎时期血管的生成，早期肿瘤干细胞分化为内皮祖细胞及前体细胞，具有了部分内皮细胞的功能但形态上更像肿瘤细胞(故而形成VM);在特定的刺激下这些肿瘤干细胞继续向内皮细胞方向分化，开始表达成熟内皮细胞的特异基因同时形态上也更像内皮细胞，这时往往被认定为内皮依赖性血管。

肿瘤局部微环境对VM的形成具有重要调控作用，其中缺氧及细胞外基质成分的改变被认为是诱导VM形成的始动因素。HIF-1为异性缺氧状态下发挥活性的转录因子，是由对氧敏感的α亚基和稳定表达的β亚基组成的异源二聚体［14］，其生物效应是由α亚基实现的。在低氧环境下，HIF-1α参与多种基因的表达，是维持细胞内氧稳态的关键因子，与肿瘤细胞对缺氧的耐受密切相关［15］，并通过调控多种下游信号分子的表达在VM形成中发挥关键作用，但分子机制目前尚不完全清楚。此外，MMP亦可通过降解细胞外基质成分促进肿瘤侵袭、浸润，为VM形成提供必要空间基础并参与其基质重塑;MMP在低分化RB组织中表达明显增高［16］。EphA2是一种受体蛋白酪氨酸激酶，在侵袭性强的肿瘤细胞中高表达［17］，其磷酸化可使GTP酶Racl和Cdc42的构象发生变化、失活，而这两种酶是三维培养形成管腔样结构所必须的;敲除EphA2表达可导致细胞不能形成血管样结构。MMP-2、EphA2的高表达可能与缺氧有关［18］。本研究显示，VM阳性RB组织中HIF-1α、E-phA2及MMP-2表达均明显高于VM阴性组织，且三者表达均与VMD呈正相关。提示HIF-1α、EphA2及MMP-2在VM的形成中发挥重要作用。

综上所述，低分化RB组织中存在VM，其管壁构成可能主要来源于ABCG2阳性的肿瘤干细胞，HIF-1α及其下游因子EphA2、MMP-2表达上调可能促进VM形成。

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