醚菊酯对日本囊对虾肝胰腺细胞DNA损伤效应的研究

刘 波, 陈宇锋, 郑惠东, 许贻斌, 郑盛华, 钟硕良

(福建省水产研究所, 福建 厦门 361013)

彗星实验又称单细胞凝胶电泳(Single Cell Eletrophoresis, SCGE), 最早由Ostling等[1]于1984年提出, 根据电泳后DNA的拖尾长度定量检测真核细胞中的 DNA损伤程度。后经其他学者不断改进, 使SCGE敏感性大大提高, 不仅可以检测到DNA双链和单链断裂, 还能检测到DNA的碱性不稳定结构[2-4]。目前, SCGE主要应用于哺乳动物淋巴细胞DNA损伤等研究领域[5-7], 在水生生物细胞损伤的研究方面报道较少, 现有研究可见 SCGE检测真鲷(Pagrosomus major)血细胞 DNA损伤及扇贝血淋巴细胞DNA损伤等报道[8-9]。醚菊酯作为常用的醚类农药,兼具了拟除虫菊酯类农药的优点, 是20世纪70年代迅速发展起来的新型农药, 具有高效、低毒、低残留等环境安全性的优点[10]。近年来, 由于菊酯类农药的广泛应用和人类活动的不断增加, 其代谢产物在食品和水环境中的影响日益严重。醚菊酯在环境和生物样品中的残留及分布表现为明显的接触性特点,这与拟除虫菊酯类农药的残留特点相似, 其对养殖生物遗传物质的基因毒性进一步引起人们的担忧。但是, 有关醚菊酯等菊酯类农药的相关研究主要集中在神经毒性和环境内分泌干扰方面[11-12], 国内外关于醚菊酯基因毒性的研究报道较少。

日本囊对虾是中国沿海地区水产养殖重要经济种类之一, 在海水养殖生物中具有良好的代表性,醚菊酯是否对日本囊对虾(Marsupenaeus japonicas)肝胰腺细胞具有遗传毒性作用而引起DNA损伤, 国内外尚未见报道。作者通过彗星实验技术研究醚菊酯对日本囊对虾肝胰腺细胞DNA的损伤特征, 探讨了醚菊酯对日本囊对虾的遗传毒性机制, 为中国沿海水产养殖环境的污染监测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

醚菊酯为广州植物龙生物技术有限公司产品;低熔点琼脂糖凝胶、绿色荧光DNA染料、EDTA溶液(0.5 mol/L)、10×细胞裂解液(0.1 mol/L Tris, 10%肌氨酸钠, 10% Triton X-100)为美国CELL BIOLABS公司产品; NaCl、NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4等常规药品均为国产分析纯试剂, 上海生物工程有限公司产品。

实验用玻片为美国Cell Biolabs公司产品, 超净工作台为苏州智净化设备有限公司的 SW-CJ-1D型,电热恒温水浴锅为上海精宏公司的DK-S26型, 电泳仪为美国 Thermo公司的EC250-90型, 水平电泳槽为北京君意公司的 JY-SP-E型, 荧光显微镜为德国Leica公司的DM5500 B型。

1.2 实验动物

实验用日本囊对虾购自福建省水产研究所大径中试基地附近的农贸市场, 平均体长(11.36±0.93)cm,平均体质量(10.72±2.70)g。在水泥池中暂养一周, 每天定时定量投喂对虾配合饲料, 挑选健康无病、附肢齐全无外伤且规格统一的对虾作为实验用虾。

1.3 处理方法

急性毒性实验表明, 日本囊对虾的死亡率与醚菊酯的浓度显著性正相关(P<0.01), 具有明显的浓度-效应和时间-效应关系, 醚菊酯对日本囊对虾24、48和 96 h 半致死浓度(LC50)分别为 1.88×10–3、1.30×10–3和 0.76×10–3mg/L。根据 LC50值和特伦堡(Tumbel)安全浓度计算公式(SC=48 h LC50×0.3/(24h LC50÷48h LC50)2), 综合考虑近海海水中醚菊酯低浓度水平因素, 设定亚急性毒性实验的处理浓度, 将日本囊对虾分为6组进行不同剂量的处理, 设置1个空白对照组, 5 个实验处理组(1.5×10–5, 0.3×10–4, 0.9×10–4,1.8×10–4, 3.6×10–4mg/L), 每组 30 尾日本囊对虾。在1 m2的水泥池内用沙滤海水微充气正常培育, 实验过程中海水溶解氧(5.62±0.18)mg/L、pH(8.06±0.08)、水温(18.36±0.26)℃、盐度(30.00±0.02)。每日更换实验用水, 重新设置醚菊酯的相应处理浓度, 保证实验期间处理浓度一致。各实验处理组在持续处理25 d后随机采集3尾日本囊对虾, 放入冰盒备用。

1.4 细胞悬液制备

剪取各实验处理组日本囊对虾肝胰腺组织0.2～0.5 g至1.5 mL灭菌离心管内, 各实验处理组设置为3组平行, 加入4℃预冷的0.01 mol/L PBS缓冲液(含0.02 mol/L EDTA)1 mL, 冰浴捣碎组织悬浮细胞, 悬浮液静置5 min后转入新的离心管, 3000 r/min离心2 min后弃上清, 用4℃预冷的0.01 mol/L PBS缓冲液重悬细胞, 调节细胞浓度为 1×105个/mL, 镜检观察细胞活性后待用。

1.5 彗星实验方法

按照Cell Biolabs公司的彗星分析试剂盒实验步骤进行单细胞凝胶电泳分析[13]。

1.5.1 制片

将彗星分析试剂盒的低熔点琼脂糖凝胶在90～95℃水浴锅内加热溶解20 min, 再转入37℃水浴锅冷却20 min备用。细胞悬液与低熔点琼脂糖凝胶按1∶10的比例混合, 迅速吸取75μL混合液均匀涂抹于彗星分析玻片上, 将玻片置于4℃冰箱避光固化15 min。

1.5.2 裂解和解旋

将玻片放入预冷的细胞裂解液(2.5 mol/L NaCl,0.1 mol/L EDTA, 0.01 mol/L Tris, 1%肌氨酸钠, 1%Triton X-100, pH10.0)中, 置于4℃冰箱避光裂解30～60 min。裂解完毕后用蒸馏水小心的冲洗玻片, 将清洗后的玻片放入预冷的碱性液(0.3 mol/L NaOH, 1 m mol/L EDTA, pH>13)中, 置于4℃冰箱避光解旋30 min。

1.5.3 电泳和染色

将玻片小心地移入水平电泳槽, 倒入预冷的碱性电泳缓冲液(0.3 mol/L NaOH, 1 mmol/L EDTA,pH>13), 在电压1 V/cm, 电流300 mA的条件下电泳15～30 min。电泳结束后轻轻移出玻片, 用预冷的蒸馏水浸泡2 min, 重复两次洗去多余碱, 再用70%酒精浸泡固化5 min。将玻片取出完全空干, 每个处理滴加100 μL的绿色荧光DNA染料, 室温避光染色15 min。

1.6 图像分析和数据处理

通过荧光显微镜观察玻片, 并进行显微摄影,每个处理采集60个细胞进行拍照和数据分析, 各实验处理组3个平行共统计180个细胞。图像用彗星分析软件Comet Score 1.5进行分析, 采用拖尾率、彗星尾长、彗尾DNA相对含量、尾距和Olive距等参数评价日本囊对虾DNA的损伤程度。其中拖尾率=拖尾细胞数/观察细胞数×100%、彗尾DNA相对含量=尾部 DNA含量/细胞总 DNA含量×100%、尾距=尾长×彗尾 DNA相对含量×100%、Olive距=头尾部中心间距×彗尾DNA相对含量×100%。应用Excel软件及SPSS16.0软件对所获得的数据进行单因素方差分析, 检验显著性并计算出回归方程。

2 结果

2.1 醚菊酯处理对日本囊对虾肝胰腺细胞DNA的影响

醚菊酯对日本囊对虾 24h和 48h半致死浓度(LC50)分别为 1.88×10–3mg/L 和 1.30×10–3mg/L, 根据 LC50值和特伦堡(Tumbel)安全浓度计算公式(SC=48 h LC50×0.3/(24h LC50÷48h LC50)2)计算得出其安全浓度为0.19×10–3mg/L。在此基础上对各实验组进行处理, 各实验组经荧光染料染色后在荧光显微镜下观察, 随机采集180个细胞进行统计分析, 空白对照组的肝胰腺细胞DNA结构紧密, 染色后呈圆形荧光团, 无拖尾现象; 各实验处理组损伤细胞DNA的断裂碎片在电场中离开核DNA向阳极迁移,染色后形成彗星状拖尾。随着处理浓度的增加, 细胞核DNA损伤越严重, 断裂的碎片或碱变性片段就越多, 彗星尾长相应增加, 尾部荧光强度也相应增强。图 1为醚菊酯不同处理浓度对日本囊对虾肝胰腺细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳彗星图像。表1是醚菊酯不同处理浓度对日本囊对虾肝胰腺细胞DNA损伤的彗星实验统计分析结果, 该实验结果表明, 不同实验处理组的拖尾率、彗星尾长、彗尾DNA相对含量、尾距和Olive距与空白对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.01), 差异极显著。实验数据显示对照组受损细胞极少, 拖尾率仅为5.06%±0.87%, 彗尾DNA相对含量、尾距和Olive距都接近0, 细胞没有发生 DNA 断裂形成彗星图像; 1.5×10–5～3.6×10–4mg/L醚菊酯处理25 d后各指标值相应增加, 且当处理剂量为 3.6×10–4mg/L时, 各指标值迅速显著增加, 说明日本囊对虾肝胰腺细胞对醚菊酯毒性存在较为敏感的阈值范围。

图1 醚菊酯不同处理浓度对日本囊对虾肝胰腺细胞DNA损伤的彗星图像Fig.1 The comet assay images of DNA damage in hepatopancreas cells of Marsupenaeus japonicas exposed to different concentrations of ethofenprox

表1 醚菊酯不同处理浓度对日本囊对虾肝胰腺细胞DNA损伤的彗星实验指标数据Tab.1 The parameters of DNA damage in hepatopancreas cells of Marsupenaeus japonicas exposed to different concentrations of ethofenprox using comet assay method

2.2 日本囊对虾肝胰腺细胞 DNA损伤各项实验指标与醚菊酯处理浓度的回归分析

表1的实验结果表明, 各实验指标数据随着处理浓度的变化显著增加, 呈现一定的剂量效应关系,各实验指标与处理浓度之间存在较好的相关性。经彗星分析软件Comet Score 1.5 得到的各项实验指标与醚菊酯处理浓度进行线性、多项式和指数拟合回归分析后, 其多项式回归分析拟合度(R2>0.99)最高,各项实验指标的回归方程如表 2所示。醚菊酯处理浓度与彗星尾长、Olive距、彗尾DNA相对含量和拖尾率等参数的多元回归方程为Y=–0.256 + 0.122X1+0.11X2– 0.0255X3– 0.044X4(P<0.005), 其中Y表示醚菊酯处理浓度,X1表示彗星尾长,X2表示Olive距,X3表示彗尾DNA相对含量,X4表示拖尾率, 回归方程相关极显著。

表2 醚菊酯不同处理浓度对日本囊对虾肝胰腺细胞DNA损伤各实验指标的回归方程Tab.2 The regression equation of parameters of DNA damage in hepatopancreas cells of Marsupenaeus japonicas exposed to different concentrations of ethofenprox

3 讨论与结论

醚菊酯作为一种广泛使用的菊酯类农药, 通过作用神经轴突, 抑制相应神经功能发挥灭杀作用[14],菊酯类农药在遗传物质基因毒性的作用机制方面研究还不多, 有研究报道表明, 菊酯类农药在各种动物实验中可导致血细胞、骨髓细胞、肝肠等组织细胞遗传毒性作用, 产生DNA双链、单链断裂和姐妹染色单体交换等现象[15-17]。作者选用拖尾率、彗星尾长、彗尾DNA相对含量、尾距和Olive距等国内外各彗星图像分析软件使用的标准指标, 应用Comet Score 1.5彗星图像分析软件对各指标进行精确的测定分析。实验结果表明, 实验选择的处理时间和浓度在彗星实验检测阈值范围内[18], 随着处理浓度的增加, 肝胰腺细胞 DNA超螺旋结构越松散, 断裂点越多, DNA碎片越小, 向阳极迁移的彗星尾部DNA片段越多, 检测指标都呈渐进的规律性趋势,表现出良好的剂量效应关系, 说明上述检测指标在本实验条件下能较客观地反映DNA损伤程度, 具有良好的代表性。这与Hellman等[19]的报道一致: 在一定的阈值范围内, 彗星尾长、彗尾DNA相对含量、尾距和Olive距等指标的分析结果比较可信。各检测指标数据表明, 醚菊酯对日本囊对虾肝胰腺细胞DNA作用较为敏感, 处理浓度在较低水平1.5×10–5mg/L时, 实验处理组与空白对照组相比各检测指标就表现出显著性差异(P<0.01), 而当处理浓度达到 3.6×10–4mg/L, 超过安全浓度 1.9×10–4mg/L(根据特伦堡Tumbel安全浓度公式计算得出)时, DNA损伤显著加剧, 该实验处理组与其他各实验处理组相比各检测指标都表现出显著性差异(P<0.01), 说明日本囊对虾肝胰腺细胞对醚菊酯毒性存在高速反应的阈值范围。

由于人类农业生产活动的广泛开展, 其长期持续用药导致近海海域生态环境低浓度长时间污染,造成养殖生物鱼、虾、贝的长期暴露, 因此, 为了全面评价醚菊酯在近海海域生态环境中的影响因子,作者对实验各检测指标进行回归分析和相关分析,数据分析表明各检测指标与处理浓度之间存在高度的相关性, 且各指标的相关系数均有统计学意义,表现出显著性差异(P<0.05), 几何参数彗星尾长是较为直接的可靠指标, 而尾距和Olive距则更能全面地反映处理浓度对肝胰腺组织细胞DNA的损伤程度。在处理浓度与彗星尾长、尾距、Olive距、彗尾DNA相对含量和拖尾率等参数的多元回归分析过程中发现, 处理浓度对尾距和Olive距的影响作用类似, 但Olive距的回归方程显著性更高(P<0.005), 尾距表现为排除的变量。多元回归方程表明, 对于日本囊对虾肝胰腺组织而言, 最好的检测参数是彗星尾长和Olive距, 即产生影响最显著的因素。本实验在对各指标分别建立一元回归方程的基础上, 又通过 SPSS软件进行聚类和判定分析, 筛选影响因子更大的检测指标, 建立了多参数的多元回归方程进行全面的DNA损伤变化规律研究, 并拟通过多元回归方程有效地推断醚菊酯处理浓度和处理时间, 为评估菊酯类农药等污染物对近海海域生态环境的影响奠定基础。

DNA损伤可以导致各种类型的突变, 包括潜在长期的致癌效应和致畸效应等[20], 作者以日本囊对虾肝胰腺细胞为研究对象, 采用标准的彗星实验分析方法对醚菊酯的遗传毒性进行检测, 证明醚菊酯对沿海地区水产养殖生物的致突变、致癌、致畸等危害作用应该引起人们的足够重视, 这种潜在长期的危害会严重影响近海海域水生生物种质资源, 造成种质衰退、种群数量减少等问题。我们认为, 菊酯类农药造成DNA损伤的主要途径是通过自由基活化,与DNA的无嘌呤位点结合形成碱性不稳定位点, 最终DNA链在碱性条件下发生断裂, 这与其他文献的观点一致[21]。研究发现, 单细胞凝胶电泳彗星实验可以在细胞分子水平直接反映出生态环境污染对水生生物的影响, 通过对 DNA损伤的评估, 这一技术手段有望成为监测近海菊酯类农药等污染物对水生生物基因毒性的新方法, 在该研究领域具有广阔的应用前景。

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