搜风祛痰法对ApoE基因敲除小鼠主动脉易损斑块炎症反应及PPARγ基因表达的影响*

安 毅 宫丽鸿 魏伟超

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110000；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110000）

动脉粥样硬化（AS）是发生在大中型动脉壁的炎症性疾病［1］，作为心血管疾病的重要病理基础与心血管事件的发生密不可分。过氧化体增殖物激活型受体（PPAR），已成为近几年动脉粥样硬化的研究热点，作为转录调节因子，PPAR参与脂质代谢、炎症及动脉粥样硬化［2］。PPARγ作为PPAR这一类配体激活的核转录因子超家族成员的表型之一，研究最为深入。PPARγ的功能广泛，参与体内众多生理和病理反应的调节，如糖代谢、脂肪代谢及细胞分化［3］。搜风祛痰中药复方稳斑汤在临床上抗动脉粥样硬化及稳定斑块作用显著，本研究则在此基础上观察其对动脉粥样硬化ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块内炎症反应的影响如何，以及对动脉组织中PPARγ基因表达的干预作用，从而探讨搜风祛痰中药复方稳斑汤抗AS发生发展的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 ApoE（-/-）小鼠和正常C57BL/6 J小鼠，6～8 周龄，SPF 级，体质量 18～20 g（北京大学实验动物中心美国Jackson实验室引进并培育成功）。

1.2 药物与试剂 稳斑汤组成：全蝎10 g，蜈蚣1条，地龙 15 g，陈皮 15 g，半夏 15 g，白术 15 g，水蛭 15 g。由辽宁中医药大学附属医院中药局提供，加工制成含生药2 g/mL中药浓缩液备用；阿托伐他汀（辉瑞制药有限公司，国药准字H20051409，规格：20 mg）。HE染色主要试剂：苏木精染液、伊红染液等（购自北京博奥森生物科技有限公司）；两步法RT-PCR试剂盒（购自北京全式金生物技术有限公司）；DNA maker（购自北京全式金生物技术有限公司）；Trizol（购自invitrogen公司）；引物（由北京三博远志生物技术有限公司代为合成）。

1.3 造模与分组 造模小鼠饲以含脂肪21%、胆固醇0.15%的高脂饲料（60Coγ灭菌照射处理），根据文献［4］同时对小鼠进行足底电流刺激，13周后，随机处死4只，去主动脉根部，HE染色观察基础AS硬化程度，确定造模成功。ApoE基因敲除小鼠60只随机分为5组，模型组、西药组及稳斑汤低、中、高剂量组各12只。正常C57BL/6 J小鼠12只正常饲料喂养13周，设为空白组。

1.4 给药方法 根据成人每日用药临床推荐的常用剂量，按成人与小鼠的体质量折算系数9.0折算成小鼠用量：稳斑汤低剂量组 61.75 g/（kg·d），稳斑汤中剂量组 123.5 g/（kg·d）， 稳斑汤高剂量组 247 g/（kg·d），西药组予阿托伐他汀0.27 g/（kg·d），正常组与模型组给予生理盐水0.3 mL/d。

1.5 标本采集及检测 取材前夜禁食，处死全部小鼠，无菌条件下取出心脏及主动脉，心脏10%甲醛固定，主动脉放在冻存管内，置于液氮中，后转移到-80℃保存备用。主动脉组织病理学观察，每组随机取5只小鼠，麻醉处死，无菌条件下于主动脉根部取4个相同切面，生理盐水冲洗，10%甲醛中性溶液固定，组织常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，切片厚度 5 μm，切片行HE染色，光镜下观察主动脉的形态。半定量RT-PCR法测定血管壁PPARγ和TLR4基因表达。总RNA抽提按invitogen公司生产的trizol说明书。最后用适量DEPC处理水溶解沉淀RNA样品，-80℃保存备用，PPARγ引物由北京三博远志生物技术有限公司代为合成。GAPDH为内参，引物序列见表1。操作严格按照RT-PCR试剂盒说明书进行RNA提取、逆转录及PCR，并且进行琼脂糖电泳，成像记录。

表1 基因引物序列

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件处理。计量资料以（）表示，组间比较用t检验，多组均数比较用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠主动脉组织形态学改变 见图1。空白对照组：动脉内膜附有一层内皮细胞，内皮细胞层呈现皱褶状排列，但排列均匀，表面光滑，未见泡沫细胞及炎性细胞。模型对照组：血管腔内可见明显的粥样硬化斑块出现，斑块表面附有纤维帽，纤维帽主要由平滑肌细胞、弹力纤维和胶原组织构成，斑块中央可见大量的脂质聚集，斑块内可见大量泡沫细胞，偶见炎性细胞浸润，未出现斑块的动脉内膜区域严重破损。中药低剂量组：血管腔内可见粥样硬化斑块，斑块面积明显小于模型对照组，斑块内脂质含量较模型组少，斑块内可见少量泡沫细胞及炎性细胞，偶见内膜残缺。中药中剂量组、中药高剂量组、西药组：动脉内膜大部分较为光滑，偶见内膜不全，内膜不全区域可见明显的脂质条纹块形成，偶见泡沫细胞聚集，有少量纤维成分交联。

图1 各组小鼠腹主动脉HE染色（100倍）

2.2 各组小鼠腹主动脉PPARγ基因表达水平 见图2，表2。各组ApoE基因敲除小鼠半定量RT-PCR结果表明：与空白组相比，模型组PPAR-γ mRNA表达水平明显增加（P＜0.01）；与模型组相比，西药组和稳斑汤各剂量组均能提高PPAR-γ mRNA表达水平 （P＜0.01）；与西药组相比，稳斑汤高剂量组提高PPAR-γ mRNA表达水平与其无差异（P＞0.05）。

图2 PPAR-γ mRNA表达

表2 各组小鼠腹主动脉组织中PPAR-γ mRNA表达水平（）

表2 各组小鼠腹主动脉组织中PPAR-γ mRNA表达水平（）

与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。

3 讨 论

AS作为炎症性疾病，炎症反应贯穿于AS发生、发展及斑块破裂血栓形成的全过程，是引起动脉壁不稳定斑块及相应并发症的中心环节［5］。在这一过程中大量的炎性因子参与其中，如TNF-α作为重要的炎性介质可通过促进MMPs表达，使纤维帽变薄，斑块趋于不稳定，此外，TNF-α还可以通过活化内皮细胞、氧化应激、血小板聚集、血栓形成来诱发ACS的发生［6］。

大量研究表明PPARγ是一个炎症反应和细胞增值的调节剂，在巨噬细胞、内皮细胞及平滑肌细胞中均有表达，它对炎症介质进行负反馈调节，抑制炎症因子的生成及炎症的形成，抗感染作用广泛而强大［7］。当巨噬细胞被激活后，PPARγ表达水平升高，通过阻止清道夫受体A、可诱导性NO合成酶及明胶酶B等的分泌来减少单核细胞分泌的IL-6、TNF-α等炎性因子，从而限制慢性炎症，在斑块区发挥抗炎作用。本研究通过光镜观察到中药各剂量组和西药组斑块区的炎症反应均明显弱于模型组；动脉粥样硬化ApoE基因敲除小鼠模型组PPARγ基因仅有少量表达，并不足以阻止动脉粥样硬化的发生发展，而中药稳斑汤各剂量组及西药他汀组均能不同程度地增加PPARγ基因表达（P＜0.01或 P＜0.05），从而使 PPARγ基因活化。

搜风祛痰法中药复方稳斑汤，其方中搜风药为虫类，走窜力强，佐以健脾燥湿化痰之药。全方共奏搜风祛痰、祛瘀通络之功效。现代药理学研究显示：全蝎可增强心肌收缩力、扩张血管、抗血栓形成；地龙可激活纤维酶原；蜈蚣扩张血管同时亦可抗心肌缺血；水蛭有较强的抗凝血作用，能改善血液流变学；陈皮对心血管系统有降脂作用，减少炎症反应、抗血小板聚集；半夏对高脂血症有治疗作用；白术能够减轻心肌耗氧、改善心肌血供。本实验结果表明搜风祛痰中药复方稳斑汤可以使血管壁PPARγ基因激活，减轻动脉粥样硬化的炎症作用，稳定易损斑块。揭示搜风祛痰稳斑汤对PPARγ的上调作用，可能是搜风祛痰中药复方稳斑汤抑制斑块内炎症反应发挥抗动脉粥样硬化作用的机制之一。

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［6］Schwart Z，Hatsukami TS，Yuan C.Molecular makers， fibrous cap rupture，and the vulnerable plaque new experimental opportunities［J］.Circulation Research，2001，89（6）：471-473.

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