反基因锁核酸体外阻断肝癌细胞系乙肝病毒S基因表达

罗艳红，邓益斌，邹佳峻

(右江民族医学院 临床学院 医学检验中心, 广西 百色 533000)

研究论文

反基因锁核酸体外阻断肝癌细胞系乙肝病毒S基因表达

罗艳红，邓益斌*，邹佳峻

(右江民族医学院 临床学院 医学检验中心, 广西 百色 533000)

目的探讨针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的效果。方法针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列，以阳离子脂质体介导，体外转染HepG2.2.15细胞，采用荧光定量聚合酶链反应技术和时间分辨免疫荧光技术分别监测2、4、6、8和10 d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg的含量;四甲基偶氮唑蓝法检测锁核酸对细胞代谢的影响。结果加入锁核酸后，对细胞内HBV DNA复制、HBsAg与HBeAg表达均有较明显的时间和剂量依赖性抑制作用，6 d后抑制率分别为52.14%、57.48%和29.63%。锁核酸对细胞代谢无明显影响。结论针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸，体外能有效抑制乙肝病毒的复制，既为乙肝病毒治疗提供有效靶位，也为反基因治疗提供理论和实验依据。

脂质体; 乙型肝炎病毒; 锁核酸; 反基因治疗

反基因治疗(anti-gene therapy)是由特定寡聚脱氧核苷酸与靶双链DNA同聚嘧啶或同聚嘌呤区专一性结合形成局部三螺旋结构，阻止靶DNA与聚合酶、转录因子等蛋白结合，实现抑制靶基因的复制与表达的目的。锁核酸(locked nucleic acid，LNA)是新发现的一种带环状结构的核苷酸衍生物[1-4]，与其他寡核苷酸相比，具有更高的热稳定性、更好的分子杂交能力、更强的抗核酸酶降解能力、更好的脂溶性和更低的细胞毒性等优势。前期研究结果表明，针对HBVS基因mRNA单链的反义锁核酸[5]和HBVpreS1[6]基因dsDNA的反基因锁核酸均能有效抑制细胞内乙肝病毒的复制。为了进一步观察锁核酸对细胞内HBV复制的抑制效果，本研究针对乙肝病毒最保守的S基因区设计合成反基因锁核酸片段，以阳离子脂质体介导，体外转染HepG2.2.15细胞系，并观察其抗病毒效果，旨在寻找新型、专一及有效的抗乙肝病毒药物。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2.2.15细胞为HBV DNA(ayr亚型)全基因转染肝癌细胞系(中国典型培养物保藏中心)， 能稳定分泌乙型肝炎病毒颗粒、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)，右江民族医学院临床学院医学检验中心常规培养于含G418 (380ITI1)、10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2条件下每5～6天传代1次。 DMEM培养基和G418(Gibco公司)。 胎牛血清(杭州四季清公司)。Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。HBV DNA定量检测试剂盒(深圳匹基公司)。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)定量检测试剂盒(苏州新波生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 反基因LNA设计与合成：从NCBI/Genome数据库中搜索得到HBV全基因序列(U95551.1;GI：2182117)，利用RNAstructure5.0软件的OligoWalk功能，根据反基因寡核苷酸作用原理及设计原则，设计并筛选出一条总自由能最低的互补于HBVS基因富含嘌呤区的寡核苷酸片段，修饰如下：1)LNA：5′-ACA△TCCA△GCGA△TA△GC-3′; 2)硫代寡核苷酸：5′-ACA#TCCA#GCGA#TA#GC-3′; 3)未修饰寡核苷酸：5′-ACATCCAGCGATAGC-3′;4)无关序列：5′-GCGTGGCTAAGCGAT-3′。以上各序列中，△代表LNA修饰，#代表S(硫)代修饰。各序列经BLAST排除与人同源后由Genelink公司合成修饰并纯化。

1.2.2 实验设计与脂质体转染：本实验设对照组和实验组。对照组包括空白对照组(blank control)和无关序列组(unrelated SEQ)。实验组包括：1)未修饰寡核苷酸组(ODN)、硫代寡核苷酸组(S-ODN)和反基因锁核酸组(AG-LNA); 2)含LNA量为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μg/L组。将HepG2.2.15细胞按1×105个/mL接种于16孔培养板，每孔100 μL，共设定10个组，每组各设6个复孔，待细胞贴壁后，分别在各组每孔中加入含LNA的脂质体-DMEM混合液1 mL，分别于2、4、6、8和10 d收集各孔培养上清液500 μL，保存于-20 ℃待测。转染按脂质体说明书操作。

1.2.3 培养上清液HBV DNA含量测定：采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测。 取培养上清液50 μL， 加等量体积DNA提取液， 充分混匀， 100 ℃恒温处理10 min， 1 200r/min离心5 min， 取2 μL上清于PCR反应管中并加入反应液， 总体积共25 μL， 各反应管放入荧光定量PCR仪， 扩增条件: 37 ℃保温2 min， 94 ℃预变性3 min， 94 ℃ 5 s， 60 ℃ 40 s， 共35个循环。 由计算机软件自动分析所收集的荧光信号并计算出定量结果， 采用计算对数平均值的方法计算HBV DNA拷贝数。

1.2.4 培养上清液HBsAg、HBeAg含量测定：采用时间分辨免疫荧光技术检测， 每个样品重复3次，严格按试剂盒说明书和仪器说明书操作， 浓度均以μg/L表示。

1.2.5 LNA对细胞的毒性检测： 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测LNA对细胞代谢活性的影响。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1反基因锁核酸对细胞内病毒基因复制与蛋白表达的影响

寡核苷酸加入6 d后，反基因LNA组对病毒DNA复制和HBsAg、HBeAg表达均显示出更强的抑制作用，抑制率分别为52.14%、57.48%和29.63%(表1)。

表1 反基因锁核酸对细胞内病毒基因复制与蛋白表达的影响

*Plt;0.05 compared with blank control and unrelated SEQ group.

2.2不同剂量反基因锁核酸对细胞内病毒基因复制与蛋白表达的影响

LNA加入6 d后，对细胞内病毒基因复制和HBsAg、HBeAg表达的抑制作用均随药物浓度增加呈递增趋势，且当浓度为0.6 μg/L时抑制作用最强，抑制率分别为60.99%、57.96%和25.18%(表2)。

2.3不同时间内反基因锁核酸对细胞内病毒基因复制与蛋白表达的影响

锁核酸加入后2、4、6、8和10 d，反基因LNA对细胞内病毒基因复制的抑制率分别为26.19%、50.00%、51.77%、50.88%和48.80%；HBsAg表达的抑制率分别为31.07%、50.39%、57.49%、60.64%和60.09%；HBeAg的抑制率分别为16.67%、27.43%、28.89%、31.07%和24.02%(表3～5)。

表2 不同剂量反基因锁核酸对细胞内病毒基因复制与蛋白表达的影响

*Plt;0.05 compared with blank control group.

2.4 锁核酸对细胞代谢的影响

用药7 d后，锁核酸组细胞活性(A值)为1.284±0.043，与对照组的1.255±0.038无差异。

3 讨论

由于乙肝病毒 DNA聚合酶缺乏校对功能，在病毒复制过程中容易产生变异株，导致病毒对药物治疗敏感性下降或耐药现象，因此，需要研究能阻断靶基因与病毒聚合酶、转录因子等结合的药物或疗法。S基因区是乙型肝炎病毒基因的一个重要开放读码框，编码的蛋白质分子是乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)的重要组成部分，不仅与病毒复制、转录、装配和分泌过程有密切关系，还与病毒感染引起的细胞及体液免疫应答反应有关。

表3 不同时间内反基因锁核酸对细胞内病毒基因复制的影响

*Plt;0.05 compared with blank control and unrelated SEQ group.

表4 不同时间内反基因锁核酸对细胞内病毒HBsAg表达的影响

*Plt;0.05 compared with blank control and unrelated SEQ group.

表5 不同时间内反基因锁核酸对细胞内病毒HBeAg表达的影响

*Plt;0.05 compared with blank control and unrelated SEQ group.

本研究针对HBVS基因富含嘌呤区设计合成反基因锁核酸片段，由阳离子脂质体介导转染HepG2.2.15细胞系，通过检测细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg等指标含量变化来评价其疗效。实验结果显示，反基因LNA对HBV DNA复制和HBsAg、HBeAg表达的抑制作用较硫代寡核苷酸更明显，说明针对S基因设计的LNA具有较强的抑制能力及靶向特异性；给药浓度不同，反基因LNA对细胞内病毒基因复制与蛋白表达的抑制作用也不同，其抑制率随LNA浓度增加呈递增趋势，出现一个平台期，当浓度为0.6 μg/L时抑制作用最强，原因可能是当脂质体量一定时，增加核酸用量，核酸分子与脂质体囊泡表面的结合达到饱和状态，此时，脂质体的载药率达到峰值，继续增加核酸用量，相邻的脂质体寡聚囊泡相互融合，形成多层囊泡，使脂质体囊泡的总表面积下降，从而导致载药率下降；反基因LNA的抑制作用还呈时间依赖性，抑制率随药物作用时间延长呈上升趋势，达到一个平台期，之后，抑制率逐渐呈下降趋势。

此外，MTT检测结果证实锁核酸对细胞的代谢活性无明显毒性作用。

综上所述，针对HBV S基因富含嘌呤区的反基因锁核酸分子，体外能有效抑制病毒基因复制和蛋白表达，为病毒性乙型肝炎反基因治疗提供理论和实验依据。

[1] Crouzier L， Dubois C， Edwards SL，etal. Efficient reverse transcription using locked nucleic acid nucleotide towards the evolution of nuclease resistant RNA aptamers[J]. Plos One,2012,7:35990-35995.

[2] Hildebrandt-Eriksen ES， Aarup V， Persson R，etal. A locked nucleic acid oligonucleotide targeting microRNA 122 is well-tolerated in cynomolgus monkeys[J]. Nucleic Acid Ther, 2012,22:152-161.

[3] Mishra S， Ghosh S， Mukhopadhyay R. Ordered self-assembled locked nucleic acid(LNA) structures on gold(111) surface with enhanced single base mismatch recognition capability [J]. Lanqmuir, 2012,28:4325-4333.

[4] Robertson KL， Vora GJ. Locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization(LNA flow-FISH):a method for bacterial small RNA detection[J]. J Vis Exp, 2012:3655.

[5] 邓益斌,张梁,王燕菲.HBV S基因反义锁核酸抑制病毒体外复制[J]. 基础医学与临床, 2010,30: 360-363.

[6] 邓益斌,温旺荣.反基因锁核酸体外抑制乙肝病毒前S1基因表达[J]. 基础医学与临床,2013,33:722-725.

新闻点击

食物太咸会导致钙流失

据美国国家科学院学报(PNAS)网站(2012-08-06)报道，在加拿大有研究发现，因为身体会调节钠与钙的浓度，当摄取太多的钠盐时，纳会通过尿液排出，但同时钙也会随之进入尿液一起排出体外。而当尿液中含有高量的钙时，就会引起肾结石，然后身体里的钙质减少了，骨头所需的钙质不足，会导致骨质疏松。

加拿大研究员通过动物及细胞实验发现了吃重咸的人会容易出现肾结石及骨质疏松的原因，研究员表示，当身体排出钠离子时，钙也会随着尿液一起排出。身体里重要的离子不只钠与钙，其中还有镁也是调节身体运作重要的物质，而钙又会与镁同时调节身体里许多机能，如肌肉的收缩等，因此，当钙流失时也会影响镁在体内的含量，导致身体的生理机能失调。

所以这就是为何一直鼓励每日低盐饮食的原因，吃太多盐除了会引发心血管疾病外，也会导致肾结石及骨质疏松。体内矿物质微量元素不平衡时，会让身体机能失常，一般大众都知道要补充钙质，但事实是其他矿物质微量元素都要一起补充才能发挥最大功效，单独一种矿物质微量元素浓度太高对身体都是不好的。

肾结石跟骨质疏松是目前满常见的疾病，且发生率越来越频繁，或许通过饮食的改变，就能降低这类疾病的发生，均衡饮食是维持身体健康的重要因素。

久坐不站增加肥胖与疾病风险

据美国国家科学院学报(PNAS)网站(2012-08-06)报道，巴西一份最新的研究指出，全球每年有530万人死于缺乏运动的相关疾病，比吸烟导致的死亡率还高。

现在很多上班族或是学生，长期坐着办公或上课，到了假日也很少出去运动，随之渐渐肥胖，心血管疾病等也随之发生。美国也有最新研究指出，调查167 000人，发现成年人每天看电视少于2 h，一天坐着时间减到3 h以内，平均寿命能多2年，就是要告诉大家不要久坐不动。长期坐着会导致身体的循环不佳，呼吸不畅，肠胃蠕动也不好，久了身体自然会变差，例如心脏疾病、2型糖尿病、一些癌症等跟不爱动有很大的关联。

其实平常上班要运动也不必强烈运动到汗流不止，一般坐在位子上也能伸展身体，甚至是每隔一段时间站起来走一下，假日也可以进行户外运动。除了运动外，现代人也缺乏均衡饮食，营养补充不足，应调整饮食，增加运动，促进新陈代谢，补充身体抗氧化物，维持健康。

Anti-gene locked nucleic acid(LNA) inhibits HBVSgene expressioninvitro

LUO Yan-hong, DENG Yi-bin*, ZOU Jia-jun

(Center for Medical Laboratory Science， the Clinical College， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of hepatitis B virus(HBV) S gene-specific anti-gene locked nucleic acid(LNA) on HBV replication and expression in hepG2.2.15 cells.MethodsThe anti-gene LNA which were complementary to the purine rich region of the HBV S gene was synthesized and transfected into HepG2 2.2.15 cells by cationic liposomes. The HBsAg, HBeAg and HBV DNA of supernatants were tested by time-resolved fluorescence immune Assay(TRFIA) and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR) at 2, 4, 6, 8 and 10 d after treatment. LNA’s cyto-toxicity on cell was evaluated by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) method.ResultsThe anti-gene LNA targeting at the purine rich region of HBV S gene showed significantly inhibitory effects on replication of HBV DNA and the expression of HBsAg and HBeAg with the inhibition rates of 52.14%, 57.48% and 29.63% respectively after 6 days.There’s no obvious toxicity on cell.ConclusionsAnti-gene locked nucleic acid targeting at the purine rich region of HBV S gene has shown significant inhibition on HBVinvitro.It has a therapeutic potential for the treatment of patients infected with HBV.

cationic liposomes; hepatitis B virus; locked nucleic acid; anti-gene therapy

2013-06-13

2013-10-09

广西壮族自治区教育厅项目(200911MS187)

*通信作者(correspondingauthor)： dyb0776@163.com

1001-6325(2014)02-0206-05

R 961

A