GDF-5联合地塞米松诱导大鼠BMSCs向类髓核样细胞分化

魏强强，殷嫦嫦，殷 明，何丁文，周荣平，梁广胜,3

(1.九江学院 转化医学重点实验室， 江西 九江 332000； 2.南昌大学 第二附属医院 骨一科；3.南昌大学 研究生院 医学部，江西 南昌 330006)

研究论文

GDF-5联合地塞米松诱导大鼠BMSCs向类髓核样细胞分化

魏强强1,2,3，殷嫦嫦1*，殷 明2，何丁文2，周荣平2，梁广胜2,3

(1.九江学院 转化医学重点实验室， 江西 九江 332000； 2.南昌大学 第二附属医院 骨一科；3.南昌大学 研究生院 医学部，江西 南昌 330006)

目的探讨 GDF-5联合地塞米松诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向类髓核样细胞分化潜能及其表型的改变。方法用全骨髓贴壁法及序贯酶消化法分别分离培养大鼠BMSCs和髓核细胞(NPCs),均取P3代细胞分为1)对照组，2)BMSCs+Dex组3)BMSCs+GDF-5组4)BMSCs+Dex+GDF-5组(联合诱导组)5)NPCs组。诱导培养21 d，镜下观察细胞形态及密度变化，阿辛蓝染色检测蛋白多糖，RT-PCR检测COL1、ACAN、SOX9及COL2和髓核细胞阳性基因KRT19、PAX1和FOXF1的表达。Western blot检测COL2及COL1蛋白表达。结果BMSCs形态呈长梭型、漩涡样生长；NPCs呈球形、岛状生长的特点；诱导后BMSCs向类圆形、三角形转变，细胞体积缩小，胞质颜色与对照组相比逐渐加深；蛋白多糖分泌增加，以联合诱导效果最佳。ACAN、SOX9、COL2基因的相对表达量逐渐增高，ACAN/COL2的比例呈递增趋势，COL1的表达呈递减趋势。NPCs阳性基因KRT19、PAX1、FOXF1与对照组相比(P<0.05)。含GDF-5的诱导组COL2蛋白表达高于对照组(P<0.05)，而联合诱导组COL1蛋白的表达最少。结论GDF-5可以诱导大鼠BMSCs向类髓核样细胞分化，且地塞米松能起到显著促进作用，为BMSCs移植治疗椎间盘退变提供了理论依据。

GDF-5；地塞米松；BMSCs；分化；类髓核样细胞

下腰痛是当今困扰人们正常生活最普遍的疾病之一，椎间盘退变是引起下腰部疼痛的最主要因素，其中髓核组织在遭受形态学及细胞变性后而导致其自身硬化以及椎间盘高度和灵活度的下降是椎间盘退变的主要原因[1]。目前在治疗上只能通过椎间盘切除的方式给患者带来显著的前期效果，但最终未能解决椎间盘退变的根本问题。

随着生物医学快速发展，利用干细胞分化技术和生长因子治疗椎间盘退变已成为全球关注的重点。大量研究表明骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)具有强大的多分化潜能，并且在体外特殊条件下具有向髓核细胞表型分化的可能[2]。而地塞米松(dexamethasone，Dex)在促进软骨细胞增殖方面也有大量报道，本实验拟通过地塞米松联合生长分化因子5 (growth and differentiation factor-5，GDF-5)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向类髓核样细胞分化，探讨其向类髓核样细胞分化的潜能以及联合诱导的优势，为BMSCs治疗椎间盘退变提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:3周龄清洁级SD大鼠雌雄不限，(武汉大学动物实验中心，合格证号：HNASLKJ20122049)。

1.1.2 主要试剂:DMEM/F12培养基(Hyclone公司)；DMEM高糖培养基、胎牛血清(Gibco公司)；Recombinant murine GDF-5 (PeproTech公司)；地塞米松(Sigma公司)；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、Ⅱ型胶原蛋白酶、Alcian Blue 8GX(Solarbio公司)；GREENspin细胞RNA快速提取试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)；HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒、Goat Anti-Rabbit IgG, HRP(北京康为世纪生物科技有限公司)； 2×Taq Master Mix(欣百诺生物有限公司)，引物合成(南京金斯瑞生物科技公司)、GAPDH多克隆抗体、COL1A2多克隆抗体(Proteintech公司)，Rabbit Anti-Collagen Ⅱ(PL Laboratories公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs及NPCs分离培养：用全骨髓贴壁法及序贯酶消化法分别培养大鼠BMSCs和NPCs(髓核细胞)，消毒处理大鼠后，分别提取大鼠长骨骨干髓腔中的骨髓液及椎间盘髓核组织，经不同方法处理后[3- 4]，骨髓悬液采用10%胎牛血清的DMEM/F12培养，待细胞长至90%汇合按1∶3传代。髓核细胞悬液采用10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，待细胞汇合90%以上按1∶2传代，期间镜下观察细胞生长情况。均取第3代细胞用于实验。

1.2.2 BMSCs向类髓核样细胞分化：取第3代BMSCs，常规消化后，调整细胞浓度为1×105个/mL，接种于24孔板中，并按以下分组更换诱导液：1)对照组(只含BMSCs)；2)BMSCs+地塞米松组；3)BMSCs+GDF-5组；4)BMSCs+Dex+GDF-5(联合诱导)组。5)NPCs组，同时将BMSCs调整浓度为1×106/mL接种于6孔板中，每孔依次按上述方法分为4组，另取第3代NPCs，常规消化后调整细胞浓度为1×106个/mL接种于同一块6孔板中，上述5组细胞均采用5% FBS+DMEM高糖培养基，其中地塞米松的终浓度为100 nmol/L，GDF-5的终浓度为100 ng/mL，每2天1次换液，诱导培养21 d。

1.2.3 聚集蛋白聚糖的阿辛蓝染色:4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS漂洗1次，0.1 mol/L 盐酸溶液漂洗5 min，pH降至1.0，1%阿辛蓝染色过夜，0.1 mol/L盐酸溶液洗脱非特异性染色。

1.2.4 RT-PCR检测相关基因的mRNA：诱导培养21 d后，将5组细胞按RNA快速提取试剂盒说明书提取总RNA，并按试剂盒说明书要求进行反转录及扩增后电泳，凝胶成像系统软件分析。此次实验目的基因如下表，其中以GAPDH作为内参(表1)。

表1 RT-PCR引物序列及产物大小

F.forward;R.reverse.

1.2.5 Western blot检测COL2、COL1蛋白:诱导培养21 d后，取1～4组按总蛋白提取试剂盒要求提取蛋白，并用2%十二烷基磺酸钠溶液溶解蛋白样品。每组蛋白上样量为50 μg(10～15 μL)，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜、TBST室温封闭2 h。4 ℃孵育过夜一抗COL2多克隆抗体(稀释比例1∶100)、COL1多克隆抗体(稀释比例1∶800)，采用GAPDH做为内参(稀释比例1∶2 000)，洗膜后采用二抗(稀释比例1∶4 000)室温孵育2 h，曝光、定影后晾干拍照，Image J软件分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行试验数据分析，数据以(均值±标准差)表示，组间比较采用单因素方差分析，Scheffe检验法进行两两比较。

2 结果

2.1 BMSCs和NPCs体外分离培养

原代培养第3天，镜下可见BMSCs部分细胞呈贴壁状态，细胞形态呈短梭形、纺锤形、多角形，细胞生长至第10天时90%汇合，细胞连接紧密，形态呈长梭形、多角形，细胞呈漩涡样生长，排列近似鱼群样。经传代纯化后，第3代细胞形态大致呈单一的长梭形，分布均匀，呈典型的鱼群样生长(图1A,B,C)。

原代培养第3天，镜下可见NPCs贴壁细胞，且呈岛状分布，形态呈多角形、三角形、类圆形及不规则等。待细胞生长至20 d时85%汇合，细胞形态呈椭圆形、球形及三角形，经几次传代后，第3代髓核细胞主要呈三角形及类圆形生长(图1D,E,F)。

2.2 BMSCs向类髓核样细胞分化的结果

含GDF-5及Dex组诱导培养21 d后细胞密度逐渐增加且细胞形态由长梭形逐渐向类圆形、三角形及不规则形态转变，细胞体积缩小，胞质颜色逐渐加深，胞核位于细胞中央清晰可见(图2B,C,D)，上述现象以(3)、(4)组更为典型(图2E,F)，而对照组类似细胞罕见(图2A)。

2.3 Alcian Blue染色的结果

诱导21 d后，含GDF-5及地塞米松诱导组通过阿辛蓝染色后可见阳性染色物质，而对照组未见明显特异性染色颗粒(图3)。

2.4 RT-PCR检测结果

ACAN、SOX9和COL2 mRNA的相对表达量均呈递增的趋势，高于对照组(P<0.05)，且联合诱导组上述3组基因的相对表达量接近NPCs的表达，同样ACAN/COL2的比值也趋近于NPCs。COL1以NPCs表达量最低，且联合诱导组的相对表达量近似于NPCs。KRT19、PAX1和FOXF1的mRNA的相对表达量远高于对照组(P<0.01)(图4)。

A.Primary BMSCs cultured for 3 days; B.Primary BMSCs cultured for 10 days; C.BMSCs at passage 3 cultured for 3 days; D.Primary NPCs cultured for 3 days; E.Primary NPCs cultured for 20 days;F.NPCs at passage 3 cultured for 3 days

图1细胞形态学的观察
Fig1Cellularmorphologyobservation(×100)

A.group control cultured for 21 days(×100);B.group BMSCs+Dex induced for 21 days(×100);C.group BMSCs+GDF-5 induced for 21 days(×100);D.group BMSCs+Dex+GDF-5 induced for 21 days(×100);E.group BMSCs+GDF-5 induced for 21 days(×200);F.group BMSCs+Dex+GDF-5 induced for 21 days(×200)

图2Dex和GDF-5诱导21d后BMSCs的形态改变
Fig2BMSCsmorphologicalchangesinducedbyDexandGDF-5for21days

2.5 Western blot检测结果

(3)和(4)组COL2含量较(1)和(2)明显增加(P<0.001)，且以联合诱导组COL2含量最高。经联合诱导后的骨髓间充质干细胞COL1表达量比单纯加入Dex和GDF-5组显著降低(图5，表2)。

A.group control cultured for 21 days; B.group BMSCs+Dex induced for 21 days; C.group BMSCs+GDF-5 induced for 21 days; D.group BMSCs+Dex+GDF-5 induced for 21 days

图3Dex和GDF-5诱导21d后细胞分泌蛋白多糖量的变化
Fig3ThecontentofcellssecretoryproteoglycanchangesinducedbyDexandGDF-5for21days(×100)

A.electrophoresis;B.relative mRNA expression ofACAN,COL2,SOX9andCOL1;C.relative mRNA expression ofKRT19,PAX1andFOXF1;D.ratioACAN/COL2;*P<0.01 compared with control;#P<0.05 compared with BMSCs+GDF-5;*#P<0.01 compared with control;ΔP<0.001 compared with control

图4诱导21d后BMSCs相关基因的表达水平
Fig4GeneexpressionofBMSCsinducedfor21days

图5 GDF-5和Dex对骨髓间充质干细胞COL2和COL1蛋白表达的影响Fig 5 Electrophoresis of COL2 and COL1 proteins expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by GDF-5 and Dexamethasone

groupsCOL2COL1BMSCs(control)18469±0061318579±01069BMSCs+Dex26098±0155121269±00144BMSCs+GDF⁃535533±01263∗11893±00090∗BMSCs+Dex+GDF⁃538440±00749∗#07501±01151∗#

*P<0.001 compared with control,#P<0.05 compared with BMSCs+GDF-5.

3 讨论

目前，已证实有两种再生法能成功治疗早期腰椎间盘退变，一种为注射生长因子[5]，其次是自体造血干细胞的应用[6]。研究发现转化生长因子家族中生长和分化因子5(GDF-5)能促进软骨细胞和退变椎间盘细胞的增殖及细胞外基质的合成[7]；自体BMSCs具有强大的多向分化潜能，能向骨、软骨、肌肉、 肌腱和神经组织分化[8]， 也具备向椎间盘组织分化的潜能[2]。研究发现地塞米松在软骨细胞的增殖方面起显著作用。如地塞米松对水凝胶培养的兔软骨细胞中发现其能促进软骨细胞的增殖，并能增加软骨相关蛋白的表达量(如Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖等)[9]。一定剂量的地塞米松连续作用BMSCs 21 d后，能诱导干细胞向软骨细胞分化，并能促进软骨细胞的转录基因SOX9表达量增高[10]。

研究表明，关节软骨细胞形态常呈圆形或椭圆形，髓核细胞通常被称为“类软骨细胞”，呈球形并主要表达聚集蛋白聚糖(ACAN)、COL2和SOX9基因[11]，与软骨细胞的标记基因相同[12]，且两者均富含蛋白多糖成分。本实验结果证实，诱导后的BMSCs形态上能向圆形及球形细胞变化，并且上述3种基因的相对表达量明显高于BMSCs对照组，蛋白多糖及COL2蛋白的表达量呈递增趋势。由此说明经GDF-5诱导后的BMSCs有向类髓核样细胞分化的潜能，且地塞米松起到显著促进作用。

细胞角蛋白-19(Cytokeratin-19，KRT-19)是大鼠髓核细胞的表面标志物，在人类的髓核细胞中也同样表达[13]。同时，聚集蛋白聚糖(ACAN)与COL2之间的基因表达比例可作为评估类椎间盘分化软骨细胞的指标[14]。且研究发现髓核细胞的阳性基因即表面标志物还包括PAX1以及FOXF1，它们是区分髓核细胞及软骨细胞关键因素[15]。本研究结果显示，KRT19、PAX1和FOXF1的mRNA表达量呈递增趋势，并接近NPCs表达量，进一步证实联合诱导后的BMSCs能向类髓核细胞分化。实验中COL1作为诱导软骨的对照基因，结果显示联合诱导组COL1基因表达量最低，说明诱导后的细胞能稳定表达软骨细胞的表型。

综上所述，GDF-5及地塞米松联合诱导后的BMSCs能向类髓核样细胞表型分化并具有一定分泌细胞外基质的功能，为今后BMSCs治疗椎间盘退变提供了更好的理论依据。

[1] Haefeli M, Kalberer F, Saegesser D,etal. The course of macroscopic degeneration in the human lumbar intervertebral disc[J]. Spine,2006,31:1522- 1531.

[2] Maerz T, Herkowitz H, Baker K. Molecular and genetic advances in the regeneration of the intervertebral disc[J]. Surg Neurol Int, 2013,4:94- 105.

[3] 顾玉荣，陈伟才，矢庆明，等. bFGF和EGF诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经样细胞[J].基础医学与临床，2013，33:444- 449.

[4] 罗元一，邬亚华. 绿原酸对过氧化氢诱导大鼠髓核细胞凋亡保护作用的研究[J].中成药，2013,34：14- 19.

[5] Koichi Masuda, Jeffrey C. Lotz.New challenges for intervertebral disc treatment using regenerative medicine[J].Tissue Eng Part B,Rev,2010,16:147- 158.

[6] Hiyama A, Mochida J, Iwashina T,etal.Transplantation of mesenchymal stem cells in a canine disc degeneration model[J]. J Orthop Res,2008,26:589- 600.

[7] Liang H, Ma SY, Feng G,etal. Therapeutic effects of adenovirus-mediated growth and differentiation factor-5 in a mice disc degeneration model induced by annulus needle puncture[J]. Spine J, 2010,10:32- 41.

[8] 牛 萍,赵月强, 黄星原.骨髓间充质干细胞体外增殖及分化过程中Notch信号的表达变化[J].基础医学与临床，2011,31:1205- 1209.

[9] Kun N,Ji HP,Sung WK,etal. Delivery of dexamethasone,ascorbate,and growth factor(TGF b-3)in thermo reversible hydrogel constructs embedded with rabbit chondrocytes[J].Biomaterials,2006,27:5951- 5957.

[10] Oshina H,Sotome S,Yoshii T,etal.Effects of continuous dexamethasone treatment on differentiation capabilities of bone marrow-derived mesenchymal cells [J].Bone,2007,41:575- 583.

[11] Adams MA, Roughley PJ.what is intervertebral disc degeneration,and what causes it?[J]. Spine (Phila Pa 1976), 2006,31:2151- 2161.

[12] Stoyanov JV, Gantenbein-Ritter B, Bertolo A,etal. Role of hypoxia and growth and differentiation factor-5 on differentiation of human mesenchymal stem cellstowards intervertebral nucleus pulposus-likecells[J]. Eur Cell Mater, 2011,21:533- 547.

[13] Lee CR, Sakai D, Nakai T,etal.A phenotypic comparison of intervertebral disc and articular cartilage cells in the rat[J]. Eur Spine J,2007,16:2174- 2185.

[14] Mwale F, Roughley P, Antoniou J. Distinction between the extracellular matrix of the nucleus pulposus and hyaline cartilage: a requisite for tissue engineering of intervertebral disc[J]. Eur Cell Mater,2004,8:58- 63.

[15] Minogue BM, Richardson SM, Zeef LA,etal. Characterisation of the human nucleus pulposus cell phenotype and evaluation of novel marker gene expression to define adult stem cell differentiation[J]. Arthritis Rheum,2010,62:3695- 3705.

Differentiation of rat BMSCs into nucleuspulposus-like cells induced by GDF-5 and dexamethasone

WEI Qiang-qiang1,2,3, YIN Chang-chang1*, YIN Ming2, HE Ding-wen2,ZHOU Rong-ping2, LIANG Guang-sheng2,3

(1.Translational Medicine Laboratory of Jiujiang University, Jiujiang 332000；2.First Dept. of Orthopedics，the Second AffiliatedHospital of Nanchang University; 3.Dept. of Medicine Graduate School of Nanchang University,Nanchang 330006, China)

ObjectiveTo investigate the NP-like cell differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells induced by GDF-5 and Dexamethasone.MethodsBMSCs were collected from Sprague Dawley rats and the feasibility of isolating and culturing rats nucleus pulposus cells (NPCs)by the sequential enzyme method.Cells at passage 3 were used and divided into control group,group of BMSCs+Dex,group of BMSCs+GDF-5,group of BMSCs+Dex+GDF-5,group of NPCs,then the cellular morphology was observed under microscope and induced for 21 days.Alcian Blue stain showed the changes of proteoglycan,RT-PCR detected expressionCOL1，ACAN,SOX9,COL2 and positive genes of nucleus pulposus cells forKRT19,PAX1,FOXF1. Western blot was used to detect COL2 and COL1.ResultsBMSCs presented a single long spindle with whirlpool-like morphology; NPCs presented spherical characteristics and island growth. BMSCs became circles, triangles, then shrinkaged and the cytoplasmic color of cells gradually deepened as compared with the control group.The content of proteoglycan was increased obviously by Co-induction.The relative expression levels of genes ofACAN,SOX9,COL2 were gradually increased,and the proportion of whichACAN/COL2 showed an increasing trend. The mRNA expression ofCOL1 showed a decreasing trend. The positive genes of NPCs forKRT19,PAX1,FOXF1 were significant different as compared with control group(P<0.05).The expression of COL2 protein in GDF-5 group was significantly increased as compared with control group (P<0.05),then the expression of COL1 protein was minimum by Co-induction.ConclusionsGDF-5 may induce rat BMSCs to differentiate into NP-like cells and dexamethasone plays a promotion effect in the differentiation of induction, and provides a theoretical basis for BMSCs transplantation in the treatment of intervertebral disc degeneration.

GDF-5；dexamethasone；BMSCs；differentiation；NP-like cells

2013- 09- 26

2013- 11- 21

国家自然科学基金(81160226)

*通信作者(correspondingauthor)： yinchangchang112@163.com

1001-6325(2014)08-1037-07

R 318.08

A

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