EMD-PLGA NPs延缓5/6肾切除大鼠诱发慢性肾功能衰竭

徐 丽，关凤军，董 晨，高莉莉，谢海涛，孙晓华

(徐州医学院 附属医院 儿科, 江苏 徐州 221000)

EMD-PLGA NPs延缓5/6肾切除大鼠诱发慢性肾功能衰竭

徐 丽#，关凤军*，董 晨，高莉莉，谢海涛，孙晓华

(徐州医学院 附属医院 儿科, 江苏 徐州 221000)

目的探讨大黄素-聚乳酸/羟基乙酸共聚物纳米粒(EMD-PLGA NPs)对5/6肾切除大鼠残余肾组织的保护作用及可能的机制。方法大鼠随机分为假手术组8只(sham组)，造模成功24只后随机分为模型组8只(model组)、大黄素组8只(EMD组)、纳米粒组8只(NPs组)，期间检测大鼠24 h尿蛋白定量、血尿素氮(BUN)和血肌酐(SCr)，光镜下观察肾组织病理变化，分别用RT-PCR法和免疫组织化学法检测肾组织转化生长因子-β1(TGF-β1)及结缔组织生长因子(CTGF)mRNA及蛋白表达。结果药物干预后，与sham组比较，model组24 h尿蛋白定量、BUN、SCr及TGF-β1和CTGF mRNA及蛋白水平上升(Plt;0.01)；与model组比较，EMD组、NPs组24 h尿蛋白定量、BUN、SCr、TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白水平下降(Plt;0.01)；与EMD组比较，NPs组24 h尿蛋白定量、BUN、SCr、TGF-β1和CTGF mRNA及蛋白水平下降(Plt;0.01)。结论与普通EMD比较，EMD-PLGA NPs能更好地延缓肾病慢性进展。

大黄素；聚乳酸/羟基乙酸；纳米粒；5/6肾切除；慢性肾功能衰竭

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure,CRF)是各种肾脏疾病晚期的共同归宿，是特征的临床综合群。各种慢性肾脏疾病最终均表现为肾脏纤维化而失去正常功能。大黄素(emodin,EMD)明确具有抗肾纤维化的作用[1-2]，但其水溶性差，不利于注射给药，且进入体内后会在短时间内大量释放，口服给药吸收速率、吸收度都很低，影响药物作用。纳米粒(nanoparticles,NPs)具有增加药物的溶解度，改善药物的吸收和提高生物利用度，改变药物的药动学性质，强的穿透组织间隙等多种作用提高药物疗效[3]。但是尚未有研究将EMD和NPs结合在一起干预慢性肾功能衰竭，纳米粒可以弥补EMD水溶性差等缺陷，将EMD微囊化，理论上可提高其在肾脏中的血药浓度与半衰期。基于此，大黄素-纳米粒(emodin-polylactic-co-glycolic acid nanoparticles,EMD-PLGA NPs)特别适用于慢性肾病的治疗。本研究用乳化溶剂挥发法制备EMD-PLGA NPs[4]，进一步研究EMD-PLGA NPs对大鼠肾脏大部分切除后残余肾单位的功能、病理损害、纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠32只，体质量180～230 g，徐州医学院实验动物中心，合格证号[SCXK(苏)2003-0003]。

1.2 模型制备、分组

大鼠先适应性饲养1周。按照随机抽签法，8只为sham组：仅将肾周脂肪钝性分离，注意保护肾上腺。24只用两步法成功制备5/6肾脏切除致CRF模型[5-7]，造模1周后将大鼠随机均分成3组， 即model组、EMD组和NPs组。

1.3 药物配制及给药

EMD标准品(≥98%，批号512-82-1，徐州市博士达科技有限公司)；羧甲纤维素钠(批号F20110110，国药集团化学试剂有限公司)；EMD-PLGA NPs制备：是通过乳化溶剂挥发法制备的，通过正交设计优化处方，在最佳条件下制得纳米粒呈圆球状或椭圆状；粒径约(100±50)nm左右；分散体系的颗粒由上而下呈逐渐变淡的弥散分布，无明显的沉积物，载药量为(18.5±3.7)%。

所有受试药物均用羧甲基纤维素钠配制成混悬液。EMD水溶性较差，但可溶解于0.5%羧甲基纤维素钠。第2次手术后1周开始灌胃给药8周，sham组、model组予0.5%羧甲基纤维素钠。EMD组给药EMD 40 mg/(kg·d)。NPs组 EMD-PLGA NPs 216.477 mg/(kg·d)。

1.4 主要试剂和仪器设备

血肌酐试剂盒和血尿素氮试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TGF-β1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；CTGF多克隆抗体和二抗(北京中杉金桥生物有限公司)。

1.5 观察指标和标本采集

1.5.1 尿蛋白定量：每2周测1次，给药前(第2次手术后1周)，给药2、4、6和8周分别将大鼠置于代谢笼收集24 h尿液，收集尿液期间禁食但自由饮水。用磺基水杨酸比浊法测定24 h尿蛋白定量。

1.5.2 血BUN、SCr：给药前和给药4周从内眦取血2 mL，实验终止时注入10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，从腹主动脉取血2 mL。采血前大鼠禁食8 h。用血尿素氮、肌酐试剂盒进行测定。

1.5.3 HE染色：分离左侧残肾，将1/2残肾切成若干小块液氮冻存，以备检测TGF-β1、CTGF。剩余肾组织以多聚甲醛固定脱水、浸蜡、包埋、切片做常规病理HE染色，HE染色行光学显微镜检查。

1.5.4 免疫组织化学染色：采用PV法，PBS代替一抗作为阴性对照染色，检测TGF-β1、CTGF的表达。

1.5.5 半定量RT-PCR：Trizol法提取肾组织总RNA，2 μg RNA行反转录。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s；54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次后，最后72 ℃延伸5 min。引物由上海生物工程有限公司合成，TGF-β1:β-actin引物：上游5′-CCAAAAGGGTCATCATCTCC-3′，下游5′-CAACCTGGTCCTCAGTGTAGC-3′扩增产物长度为499 bp；TGF-β1引物：上游5′-GAACCAAGGAG ACGGAATACAG-3′，下游5′-AACCCAGGTCCTTCCT AAAGTC-3′，扩增产物片段为298 bp。CTGF:β-actin引物：上游5′-GACCTTCAACACCCCAGCCA-3′，下游5′-GTCACGCACGTTTCCCTCTC-3′扩增产物长度为258 bp；CTGF引物：上游5′-GCGTAAAGCCAGGGA GTA-3′，下游5′-AGCAGTTAGGAACCCAGATT-3′，扩增产物片段为133 bp。扩增产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像并用计算机图像信号分析，结果以目的片段与β-actin片段的条带吸光度的比值作半定量比较。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠尿蛋白定量的变化

1周后5/6肾切除大鼠尿蛋白定量较sham组有所升高(Plt;0.01)。EMD组和NPs组尿蛋白定量显著低于model组(Plt;0.01)；NPs组尿蛋白定量显著低于EMD组(Plt;0.01)(表1)。

2.2 各组大鼠血BUN、SCr的比较

1周后5/6肾切除大鼠BUN、SCr 明显高于sham组(Plt; 0.01)。干预4周、8周，EMD组、NPs组BUN、SCr显著低于model组(Plt; 0.01)，干预组BUN、SCr升高趋势较model组明显缓慢；NPs组BUN、SCr显著低于EMD组(Plt;0.01)(表2)。

2.3 各组大鼠肾脏组织学改变

2.3.1 各组大鼠肾组织HE染色：sham组大鼠肾小球、肾小管及肾间质结构正常。Model组肾小球结构紊乱，系膜增生较严重，呈弥漫性硬化、纤维化，肾小管管腔扩张明显，可见蛋白管型，部分肾小管上皮细胞浊肿，肾间质可见炎性细胞浸润，肾间质纤维化明显。EMD组部分肾小球毛细血管襻呈分叶状，呈局灶节段性硬化，肾小球系膜轻度增生，部分肾小管管腔扩张，未见蛋白管型，间质见炎性细胞浸润。NPs组肾小球病变较轻微，系膜轻度增生，肾小球硬化不明显，未见球囊粘连，肾小管轻度扩张，间质少量炎性细胞浸润(图1)。

表1 各组大鼠尿蛋白定量变化Table 1 Urine protein in different groups(±s, mg/24 h,n=8)

△Plt;0.01 compared with sham group；*Plt;0.01 compared with model group；#Plt;0.01 compared with EMD group.

表2 各大鼠血BUN、SCr变化Table 2 BUN, SCr in different groups(±s, n=8)

△Plt;0.01 compared with sham group；*Plt;0.01 compared with model group；#Plt;0.01 compared with EMD group.

2.3.2 各组大鼠免疫组织化学染色的比较：sham组大鼠肾组织TGF-β1、CTGF呈弱表达，model组TGF-β1、CTGF免疫染色强度和面积明显增加，EMD组、NPs组依次减弱(图2，3)。与sham组比较，model组TGF-β1、CTGF表达上调(Plt;0.01)；与model组比较，EMD组、NPs组TGF-β1、CTGF表达下调(Plt;0.01)；与EMD组比较，NPs组TGF-β1、CTGF下调(Plt;0.01)(表3)。

2.3.3 TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA的表达：给药干预8周后，各组大鼠肾组织TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA灰度值比较结果显示：与sham组比较，model组TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA表达上调(Plt;0.01)；与model组比较，EMD组、NPs组TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA表达下调(Plt;0.01)；与EMD组比较，NPs组TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA表达下调(Plt;0.01)(图4，5;表4)。

A.sham group；B.model group；C.EMD group；D.NPs group图1 各组大鼠肾组织Fig 1 The renal tissue in different groups(×400)

A.sham group；B.model group；C.EMD group；D.NPs group图2 各组大鼠TGF-β1免疫组化表达Fig 2 Expression of TGF-beta 1 immunohistochemical in different groups(×400)

A.sham group；B.model group；C.EMD group；D.NPs group图3 各组大鼠CTGF免疫组化表达Fig 3 Expression of CTGF immunohistochemical in different groups(×400)

表3 各组大鼠TGF-β1、CTGF A值比较Table 3 Comparison of TGF-beta 1, CTGF A value

△Plt;0.01 compared with sham group；*Plt;0.01 compared with model group；#Plt;0.01 compared with EMD group.

1.sham group；2.model group；3.EMD group；4.NPs group图4 各组别大鼠TGF-β1 mRNA表达Fig 4 Expression of TGF-beta 1 mRNA in different groups

1.sham group；2.Model group；3.EMD group；4.NPs group图5 各组别大鼠CTGFmRNA表达Fig 5 Expression of CTGF mRNA in different groups

表4 实验结束时各组大鼠TGF-β1、CTGF mRNA表达比较Table 4 Comparison of TGF-beta 1, CTGF mRNA

△Plt;0.01 compared with sham group；*Plt;0.01 compared with model group；#Plt;0.01 compared with EMD group.

3 讨论

目前国内外尚无可完全控制CRF的进展最理想的药物，针对CRF病变慢性进展机制及相应的治疗一直是研究的热点。结合大黄素、纳米粒的特点，EMD-PLGA NPs特别适用于慢性肾病的治疗。国内已有研究者制备了大黄素固体脂质纳米粒，并对其行大鼠体内药学评价[8]，但尚未进行动物模型干预研究。

本研究采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Polylactic-Co-Glycolic Acid, PLGA)作为药物控释传递的载体。PLGA已通过美国 FDA 认证，具有良好的生物相容性、无毒、无刺激性、无免疫原性和药物缓释等特性[9]。本研究成功制备PLGA大黄素纳米微囊，采用正交设计优化处方工艺，经过透射电镜、激光粒度仪、紫外分光光度机等检测，证实其具有粒径小、水溶性好、载药率较高、稳定性好等特点。

5/6肾切除大鼠模型病理生理学变化与CRF高度符合，且可重复性好, 被广泛用于慢性进展性肾病的相关研究[10-12]。TGF-β1是介导肾小球硬化和肾间质纤维化关键细胞因子，在肾纤维化过程中TGF-β1起着关键作用[13-15]。CTGF是其下游效应因子，在正常生理时表达水平较低，生物学效应较单一，在病理状态时过度表达，可促进细胞增生和ECM在间质沉积，从而参与肾间质纤维化的发生发展[16]。因此阻断内源性CTGF表达或抑制其活性可能是更特异、更有效的抗纤维化治疗手段。

本研究中，model组大鼠TGF-β1、CTGF表达均明显升高；肾小球结构紊乱，系膜增生较严重，肾小球呈弥漫性硬化、纤维化，肾小管管腔扩张明显，可见蛋白管型，部分肾小管上皮细胞浊肿，肾间质可见炎性细胞浸润，肾间质纤维化明显；尿蛋白量明显增加，血尿素氮、肌酐水平升高。干预后，与普通EMD比较，NPs组上述两种因子表达明显降低，肾脏病理改变减轻，同时，尿蛋白量亦明显减少，提示EMD-PLGA NPs可能通过抑制TGF-β1、CTGF的表达延缓肾脏纤维化，减轻肾脏病理改变，减少尿蛋白量，清除BUN、SCr，较普通EMD更好地发挥肾脏保护作用。

上述研究结果可能为拓展慢性肾脏病变防治提供新的依据。但具体机制尚不完全明确，可能与药物半衰期延长或因药物粒径变小引起药代动力学发生变化有关，可做进一步研究，并对纳米粒进行靶向性修饰研究。

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Emodin-polylactic-co-glycolic acid NPs delays chronic renal failure by 5/6 nephrectomy

XU Li#, GUAN Feng-jun*, DONG Chen, GAO Li-li, XIE Hai-tao, SUN Xiao-hua

(1.Dept. of Pediatric, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221000,China)

ObjectiveTo explore the kidney protecting effect and possible mechanism under which the renal tissues in 5/6 nephrectomy rats was intervened by emodin-polylactic-co-glycolic acid nanoparticles.MethodsRats were randomly divided into two groups, eight as sham-operated group and twenty-four as model group. Twenty-four rats in model group were randomly and equally assigned into model group (model group), emodin group eight(EMD)and nanoparticles group eihgt (NPs). Drugs were given to rats in different groups for a total 8 weeks, then 24 h urine protein, blood urea nitrogen (BUN)and creatinine (SCr) were measured; kidney pathological changes were observed under optical microscope; protein and mRNA expression of growth factor beta-1(TGF-β1) as well as connective tissue growth factor (CTGF) in renal tissues were detected respectively by RT-PCR methods and immunohistochemistry.ResultsAfter treated with drugs,compared with sham group,24 h urine protein, blood urea nitrogen, serum creatinine, mRNA and protein expression of TGF-β1 and CTGF of rats in model group were both in-creased(Plt;0.01). Compared with model group,24 h urine protein,blood urea nitrogen,serum creatinine, mRNA and protein expression of TGF-β1 and CTGF of rats in EMD group and NPs group were both decreased(Plt;0.01);Compared with EMD group,24 h urine protein,blood urea nitrogen,serum creatinine, mRNA and protein expression of TGF-β1 and CTGF of rats in NPs group were both decreased(Plt;0.01).ConclusionsEMD-PLGA NPs inhibits renal fibrosis and slows down the progress of chronic kidney disease.

emodin;polylactic-co-glycolic acid;nanoparticles;5/6 nephrectomy;chronic renal failure

2013-04-15

2013-10-09

徐州市科技基金计划发展项目(XM09B047)

#现工作单位：临沂市妇幼保健院儿科

*通信作者(correspondingauthor)： guanxiaomu@sina.com

1001-6325(2014)03-0318-06

研究论文

R-332

A