T-SPOT.TB在肺结节病与肺结核鉴别诊断中的应用价值

叶秋月，许文兵，刘晓清，张丽帆

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1.国际医疗部； 2.呼吸内科； 3.感染内科, 北京 100730)

T-SPOT.TB在肺结节病与肺结核鉴别诊断中的应用价值

叶秋月1，许文兵2*，刘晓清3，张丽帆3

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1.国际医疗部； 2.呼吸内科； 3.感染内科, 北京 100730)

目的通过T-SPOT.TB检测，探讨其在肺结节病和肺结核鉴别诊断中的应用价值。方法检测2008年1月至2011年3月在北京协和医院确诊的44例肺结节病和30例肺结核患者并进行对比。结果44例肺结节病患者T-SPOT.TB阳性12例(27.3%)，30例肺结核患者阳性27例(90%)；肺结节病患者ESAT-6和CFP-10肽段合并的分泌IFN-γ细胞频数是46 SFCs/106PBMC(IQR 28～204)，显著低于肺结核患者565 SFCs/106PBMC(IQR 170～2340)。结论T-SPOT.TB检测有助于鉴别诊断肺结节病与肺结核。

肺结节病；肺结核；鉴别诊断；ELISPOT；T-SPOT.TB

结节病是一种病因不明的多系统器官受累的非干酪性类上皮样肉芽肿性疾病，其与结核病有许多相似之处，但两者治疗完全不同，鉴别诊断是临床难题。有Meta分析显示结节病患者组织标本中分枝杆菌DNA的检出率为30%，高于正常健康人群，而亦有结果相反的研究[1]。中国是结核高发的国家，在诊断结节病时尤应注意除外结核或合并结核病。T-SPOT.TB是一项新的诊断结核感染的免疫学方法，它是应用酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)检测机体内经结核特异性的RD1区编码抗原EAST-6和CFP-10肽段库刺激后释放γ干扰素的特异性T细胞数量[2-3]。作为一项新的诊断结核感染的高敏感性、高特异性检查，已经广泛地被应用于临床。本研究拟从临床角度分析T-SPOT.TB作为一项诊断结核的新技术能否帮助提高医生对两种疾病的鉴别诊断。

1 对象和方法

1.1 研究对象

回顾性选取北京协和医院2008年1月至2011年3月就诊的肺结节病患者及肺结核住院患者，肺结节病患者及肺结核患者需满足以下条件：1) 结节病病例均取得病理组织活检，表现为非干酪样坏死性肉芽肿，病理形态及抗酸染色均未发现结核分枝杆菌感染的证据；经糖皮质激素治疗后症状、影像有好转或观察过程中影像能自行消散；2)肺结核病例均符合：a细菌学检查痰或支气管吸取物、肺组织萋-尼染色阳性，或痰及肺组织中MTB(结核分枝杆菌)快速培养阳性；b 肺组织或淋巴结活检病理表现为上皮样肉芽肿伴干酪样坏死的典型结核病变，有或无抗酸染色阳性结果；c 经抗结核治疗有效，肺部阴影吸收。同时具有a+c或b+c者可确诊肺结核病。3)以上患者均获得知情同意后送检T-SPOT.TB检查。

1.2 研究方法

回顾分析两组病例临床资料，按设计表格收集资料，记录两组患者临床表现、T-SPOT.TB、结核菌素试验(TST)等结果。

T-SPOT.TB检测按T-SPOT．TB试剂盒操作规范进行。取患者静脉血4 mL，肝素抗凝，6 h内分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，用细胞培养基AIM-V重悬细胞，并将浓度调整至2.5×106/mL。在已包被抗IFN-γ单抗的96孔板上，分别单孔加入50 μL细胞培养基作为空白对照，50 μL植物血凝素作为阳性对照，分别以50 μL结核分枝杆菌特异性ESAT-6和CFP-10肽段库(终浓度10 mg/L)作为刺激原(Oxford Immunote Ltd.，Oxford, EngLand)。然后在每个孔中加入100 μL上述细胞悬液。把96孔板放在37 ℃孵育箱培养16～20 h后，用PBS液洗板4次，加入碱性磷酸酶标记的二抗，在2～8 ℃下孵育1 h，孵育后再用PBS液洗板4次。最后每孔加入显色底物液5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐/四氮唑蓝(BCIP/NBTPLUS)，室温中静置7 min后去离子水终止反应。观察结果，并用ELISPOT计数仪(AID iSPOT Reader spectrum，ZEISS, Germany)进行斑点阅读与统计。空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点数大于20时视为实验有效。当ESAT-6或CFP.10任一检测孔达到以下标准则判定为阳性结果：1)如果空白对照孔斑点数≤5个，检测孔斑点数减去空白对照孔斑点数≥6。2)如果空白对照孔斑点数≥6个，检测孔斑点数必须gt;2倍的空白对照孔斑点数。T-SPOT.TB的实验结果用每百万个外周血单个核细胞中斑点形成细胞(spot-forming cell，SFC)的个数来描述，每百万个外周血单个核细胞中斑点形成细胞lt;24为阴性，≥24为阳性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组患者一般情况

本研究入选肺结节病患者44例，肺结核患者30例。肺结节病组男11例，女33例；平均年龄(47±11.9)岁，病程3天～17年，中位病程3月(IQR， 2～11.3)。肺结核病组男18例，女12例；平均年龄(49.1±17)岁。病程15天～7年，中位病程3.5月(IQR，1～12)。

2.2 两组患者T-SPOT.TB 检测结果分析

肺结节病组T-SPOT.TB 检测的阳性率为27.3%(12/44)，显著低于肺结核组的90%(27/30)(Plt;0.001)。肺结节病组T-SPOT.TB斑点形成细胞数范围为0～544 SFCs/106PBMC 和中位数为46 SFCs/106PBMC(IQR，28～204)；显著低于肺结核组的0～7308 SFCs/106PBMC和中位数为565 SFCs/106PBMC(IQR，170～2340)(Plt;0.001)(计算T-SPOT.TB中位数时剔除了0值)。两组T-SPOT.TB斑点形成细胞分布(表1)。

2.3 两组患者TST检查结果分析

44例结节病患者中有35例同时进行了TST检查。TST结果以硬结直径≥10 mm判为阳性，TST阳性率为11.4%(4/35), T-SPOT.TB阳性率为25.7%(9/35)；在肺结节病组，T-SPOT.TB阳性率较TST无明显增高。30例肺结核患者中有18例同时进行了TST检查， T-SPOT.TB阳性率为88.9%(16/18),显著高于 TST的阳性率55.6%(10/18)(Plt;0.05)。

2.4 治疗和预后

44例结节病患者随访1～36 m，平均(8.3±6.7)月。其中有13例给予正规四联抗结核治疗1～14 m，平均(6.2±4.3)月，肺内异常影像无吸收改善。有9例结节病最初未用药，临床观察中随访中8例复查CT自行缓解，1例纵隔淋巴结增大遂加用皮质激素后肺内阴影明显吸收；25例使用口服强的松初始剂量30～40 mg/d治疗，3～36月，平均8.6±7.0月，24例影像有改善，1例最初用药效果可，后减量过程中反复，逐步发展为IV期结节病。有6例给予口服强的松30～40 mg/d同时予免疫抑制剂，有4例加用MTX 10 mg/w，1例加用依木兰100 mg/d，1例加用CTX 100 mg/d，6例影像均有改善。有4例单纯使用布地奈德粉剂吸入，CT均有不同程度改善。结节病组中12例T-SPOT.TB阳性患者其中有2例观察，2例使用布地奈德喷喉，影像均有不同程度改善。8例加用强的松口服，其中6例初始曾单用抗结核药时症状、CT改善不明显，加用皮质激素后8例患者中7例症状及影像均有明显改善，1例最初有好转，但减量过程中有反复。肺结核病组30例均给予正规抗结核治疗，临床及影像均有好转。

3 讨论

结节病是非干酪性肉芽肿性疾病，与结核病同为肉芽肿性疾病，但两者的治疗不同，如何准确地将两者区分极为重要。

长期应用的诊断结核感染的TST存在许多缺陷，如在普遍接种卡介苗(Bacillus Calmett Guerin, BCG)的地方有很高的“假阳性率”；而在免疫低下人群有许多“假阴性”[4]；且TST的操作规范、结果判读主观性较强，严重影响结果准确性。T-SPOT.TB的原理是应用ELISPOT检测经结核特异性的RD1区编码抗原EAST-6和CFP-10肽段库刺激后释放γ干扰素的特异性T细胞数量诊断结核感染。目前已有多个研究证实T-SPOT.TB诊断结核感染有很高的敏感性和特异性[3,5-8]。Meta分析表明T-SPOT.TB的综合敏感性为90%，综合特异性为93%[3]。本研究中肺结核组的T-SPOT.TB的阳性率显著高于TST阳性率，充分说明了T-SPOT.TB较TST有更好的敏感性。

T-SPOT.TB结果与结核菌菌量、疾病活动状态具有一定的相关性[9]。本研究中44例肺结节病的T-SPOT.TB阳性率、EAST-6和CFP-10肽段库合并的分泌IFN-γ细胞频数显著低于肺结核病组，说明T-SPOT.TB可很好的鉴别肺结节病和肺结核；本研究还提示若T-SPOT.TB值小于50，肺结核可能性小，肺结节病可能性大；而T-SPOT.TB值大于50时，肺结核可能性大。若T-SPOT.TB值大于600，基本可除外肺结节病的诊断。

结节病组有12例 (27.3%)的T-SPOT.TB阳性。韩国某研究报道非结核病患者T-SPOT.TB阳性率为28.5%(39/137),认为可能与韩国高达30%的潜伏结核感染有关[10]；本研究中阳性率与其相近，考虑可能与我国人群中结核潜伏感染的发生率高有关。

表1 肺结节病组和肺结核病组T-SPOT.TB斑点形成细胞数值分布表Table 1 Numerical distribution of T-SPOT.TB spots in sarcoidosis group and pulmonary tuberculosis group

由于结节病患者细胞免疫功能受抑制，故目前国内或国外均以结核菌素试验(TST)阴性或弱阳性作为结节病重要的诊断及鉴别诊断参考指标。印度112名结节病患者行TST，结果提示结节病患者的TST阳性率并不受所处人群(如印度)TST的高阳性率影响，所以当结节病患者感染结核，TST并不是良好的筛查指标[11]。本研究提示T-SPOT.TB能较TST更敏感地筛查出结节病患者中的潜伏结核感染(未发表资料)，这部分结节病患者需要使用皮质激素治疗时，是否可参考T-SPOT.TB的值来决定是否需同时加用抗结核治疗以减少活动性结核发生，尚需进一步研究。

综上所述， T-SPOT.TB可作为一项新方法协同鉴别诊断肺结节病与肺结核，并进一步指导临床治疗。

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The value of T-SPOT.TB in the differential diagnosis of sarcoidosis and pulmonary tuberculosis

YE Qiu-yue1， XU Wen-bing2*，LIU Xiao-qing3，ZHANG Li-fan3

(1.the International Medical Department; 2.the Respiratory Medical Department;3.the Infectious Diseases Department, PUMC Hospital, CAMS amp; PUMC, Beijing 100730, China)

ObjectiveT-SPOT.TB is a new method to diagnose tuberculous infection through detecting the frequencies of IFN-γ producing T cells which respond to the M.tuberculosis specific antigens encoded by the RD1 region(ESAT-6 and CFP-10). This study aimed to evaluate the role of T-SPOT.TB in the differentiation of the sarcoidosis and tuberculosis.MethodsThe data of T-SPOT.TB of 44 sarcoidosis and 30 pulmonary tuberculosis patients in PUMCH between January 2008 and March 2011 were analysed.ResultsAmong the 44 sarcoidosis patients,the T-SPOT.TB result was positive in 12 patient (27.3%),while among the 30 pulmonary tuberculosis patients,the T-SPOT.TB result was positive in 27 patient (90%).Pooled frequencies of ESAT-6 and CFP-10 specific IFN-γ secreting T cell was 46SFCs/106PBMC(IQR 28～204) for sarcoidosis patients,significantly lower than that for pulmonary tuberculosis patients which was 565 SFCs/106PBMC(IQR 170～2340).ConclusionsT-SPOT.TB is a potential method for the differentiation of sarcoidosis from pulmonary tuberculosis.

sarcoidosis；poulmonary tuberculosis；differential diagnosis；ELISPOT；T-SPOT.TB

2013-04-01

2013-10-28

*通信作者(correspondingauthor)： xuwenbing@qq.com

1001-6325(2014)04-0527-04

研究论文

R 714.253

A