陕西烟草青枯病的发生与病原鉴定

成巨龙，罗晶，邹航，柯美福，牛俞德，安德荣

1 陕西省烟草公司，西安 710061;

2 西北农林科技大学，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100

植物保护

陕西烟草青枯病的发生与病原鉴定

成巨龙1，罗晶2，邹航2，柯美福1，牛俞德1，安德荣2

1 陕西省烟草公司，西安 710061;

2 西北农林科技大学，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100

2013年7月在陕西省西乡县韩岭村烟田首次发现疑似烟草青枯病病株,为了解陕西烟草青枯病的发生危害，对陕西省不同烟区的烟草青枯病的发生情况进行系统调查，并对田间采集的具有典型青枯病症状的烟草茎部样本进行了病原鉴定。结果表明：陕西省烟草青枯病发生区域为陕南的汉中、安康和商洛3个烟区，延安、宝鸡和咸阳的三个烟区尚未发现。发病始于6月上旬，盛发于7月中旬。该病害随温度升高而病情加剧，发病早期田间死苗严重，发病率可高达24.67%，而且有蔓延扩展趋势；通过对烟草茎秆上分离的病原细菌进行形态观察、致病性测定、生理生化性状等常规细菌鉴定比较，结合细菌16S rDNA序列分析，鉴定该病原菌为青枯劳尔氏菌Ralatonia solanacearum。

烟草青枯病；病原鉴定；青枯劳尔氏菌

烟草青枯病是一种严重危害烟草生长和品质的顽固性细菌病害，烟草感病后会造成严重产量和质量损失。该病常发生在热带、亚热带及部分温带地区。目前我国该病主要在长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、江西、广西东部、安徽南部、四川、云南及贵州局部烟区为害严重[1-2]，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。由于温室效应的加剧，该病的发生危害有向北方烟区扩展的趋势，目前在山东、河南及辽宁等省相继有发生报道[3]，且局部地区危害较重。陕西地处中国内陆腹地，黄河和长江流域中部，陕西烟田青枯病的发生、危害和症状特点及发病规律等尚无报道。本文针对上述问题，结合全国烟草有害生物第二次调查要求，对烟草青枯病在陕西的发生情况、症状和病原菌鉴定进行了系统研究。

1 材料

培养基:LB固体培养基（胰蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂15～20 g/L）；TTC培养基（胰蛋白胨 17 g/L，大豆胨3 g/L，NaCl 2.5 g/L，葡萄糖6 g/L，硫乙醇酸钠0.5 g/L，L-胱氨酸0.25 g/L，亚硫酸钠0.1 g/L，琼脂15～20 g/L，pH 7.2±0.1）。供试烟草：NC89。IQ5定量PCR仪，美国伯乐公司产品；DK-8D型电热恒温水槽，上海森信实验仪器有限公司产品；DYY-8型稳压稳流电泳仪，上海琪特分析仪器有限公司产品；CP100WX超速离心机，日本日立公司产品；H6-1微型电泳槽，上海精益有机玻璃制品仪器厂产品；Gel Doc XR+凝胶成像分析系统，美国BIO-RAD公司产品；NICOLET300紫外分光光度计，美国热电公司产品；3130XL DNA自动测序仪，美国ABI公司产品；DV805A TaKaRa胶回收试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司。

2 方法

2.1 病害调查和样本采集

在2010—2013年全国烟草有害生物第二次调查时，在陕西6个地区18个不同生态条件的烟田进行采样和调查，其中在陕西省汉中、安康和商洛烟区均发现有典型烟草青枯病症状的烟株。在田间切取8 ㎝左右感病茎杆，装入封口塑料袋中带回进行病原分离、鉴定。

采取定点观察的方法，选择陕西省安康市旬阳县、宝鸡市陇县、汉中市西乡县、延安市富县、咸阳市旬邑县以及商洛市镇安县等烟田进行病害系统调查。首先在烤烟旺长期进行大田观察，发现病株后进行定点定株定时观察，选取同一地点的100株病株，每隔3 d观察发病情况，至收获。其次,在大田烟草青枯病病情基本稳定后进行一次病情调查，了解大田中烟草的发病情况,采用对角线五点取样法，每个点选取50株，统计田间发病率。

2.2 病原分离和纯化

分离病菌前，将茎秆冲洗干净，用75%的酒精对茎秆和小刀消毒，然后在无菌条件下，用小刀剖开茎秆上的病斑，将感病维管束组织切成若干小块，用无菌的镊子夹取烟块于直径为10㎝的含LB固体培养基的培养皿中，每个皿中放4～5块，重复3次，培养温度为28℃～30℃，培养48 h[4]，待烟块于培养基接触处长出白色流动性菌落并且向外分散细小丝状菌块时，挑取菌落少许，在TTC培养基上划线分离，每个样本挑取呈典型的青枯劳尔氏菌落形态（中央呈粉红色、周围乳白色、流动性较强）的单菌落在TTC培养基上划线纯化。

2.3 致病性测定

供试烟草品种为NC89。在盆钵内将烟草种子播种后，待烟株生长到有维管束组织时（5-6片叶），用小刀在烟草茎基部切一斜口，用胶头滴管将事先培养好的病原菌悬液滴在开口处，并用蘸有菌液的棉球包在伤口处、烟苗外套保鲜袋保湿。以灭菌水作对照，过一段时间观察发病状况[4]。

2.4 病原鉴定

2.4.1 病原菌的生理生化特性

取培养18 h的细菌单菌落，涂于载玻片上进行负染色，电镜下观察菌体的形态大小、鞭毛特性；菌体的菌落特征及生理生化指标测定参考《常见细菌系统鉴定手册》[5]。菌落形态主要观察单菌落形状、大小、颜色、表面、边缘、隆起特性、透明度等。生理生化主要进行糖类发酵试验、石蕊牛乳试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、吲哚及氨的产生试验、乙酰甲基甲醇试验、产生硫化氢试验、淀粉水解试验8个指标。

2.4.2 病原菌16S rDNA序列的测定

从已进行致病性测定的菌株中选出致病性最强的菌株进行16S rDNA测序，以f27/r1492为引物（f27：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；r1492：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）[6]。PCR 反应采用25μL体系：10×Buffer 2.5μL、上游引物（10 μM） 0.5μL、下游引物（10μM）0.5μL、dNTP mix(10Mm each)0.5μL、Tap（5u/μL）0.2μL。反应程序：94℃预变性 5min；94℃ 30 s，55℃ 35 s，75℃1 min，35个循环；72℃ 8 min。PCR产物进行制备形琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收法回收。扩增产物进行测序，所获得的序列在GenBank中进行BLAST同源性分析

2.5 回接实验和再分离

取同源性最高的菌株，在TTC平板上28℃活化培养，36h后将菌苔刮下，用无菌水配成浓度为3×108CFU/ml的菌悬液用于接种。盆栽NC89漂浮苗，成活后用刀伤根，每根灌菌悬液10ml。以自来水为对照。每菌株接种3株，常规管理。接种后每隔4d观察症状[7]。在烟株表现茎部和下部叶片黑色坏死后，取样分离病菌，并对分离得到的菌株进行16S rDNA测序，验证是否为青枯劳尔氏菌。

3 结果与分析

3.1 陕西烟田发病概况

根据调查统计结果(表1)，烟草青枯病发生区域为陕南汉中、安康和商洛等三个烟区，最高发病率可达24%以上，延安、宝鸡和咸阳等三个烟区尚未发现。通过系统观察发现，田间烟草青枯病6月上旬开始发病，7月中旬盛发，时雨时晴的闷热天气病情发展较快，随温度升高病情加剧。发病30d后，病情有所缓慢。此外，地势低洼以及有积水的田块，烟草青枯病发病较重，沿沟渠两岸的沙质土壤上所种植的烟草发病也较为严重。

3.2 病原菌的分离及致病性测定

从感病的烟株中分离纯化后得到5个菌株JL 1、JL 2、JL3、JL4和JL5。2013年7月23日将分离的供试菌株JL1、JL2、JL 3、JL 4和JL 5分别接种20株烟株，经过15～20 d后接种烟株均出现典型的青枯病症状：发病初期烟株叶片萎蔫下垂，随后萎蔫叶片自下而上变黄、枯死，但是叶片的主脉和侧脉常不变黄；在茎秆基部的外表皮上常伴有明显的黑褐色病斑，若用刀横切茎基部，剖开表皮，发现维管束变褐且有污白色菌脓（如图1）。接种JL1菌株的烟株发病率最高达80%。

图1 青枯病症状Fig.1 Bacterial wilt symptoms

3.3 病原菌的生理生化特性

JL1菌株在LB培养基上，菌落为圆形，稍突起，乳白色有光泽。在TTC培养基上，菌落中央呈粉红色，周围乳白色，流动性强，呈现典型的青枯劳尔氏菌菌落形态(如图2)。病原菌为短杆状，大小为1.56～2.28×0.59～0.91μm（如图3）。该病原菌生物化学性状的测定结果如表2。

图2 LB培养基(a)和TTC培养基（b）上的病原菌菌落形态Fig.2 Pathogen colony morphology on the LB culture medium（a）and TTC culture medium(b)

图3 透射电镜（a）和扫描电镜（b）下病原菌形态Fig.3 Pathogen bacteria morphology under the transmission electron microscope(a)and scanning electron microscopy(b)

表2 病原菌生物化学性状测定结果Tab.2 Determination of biochemical properties of pathogenic bacteria

3.4 病原菌的16SrDNA序列测定

以JL1基因组DNA为模板，用f 27/r1492引物进行PCR扩增，测得该菌株的16S rDNA核苷酸序列长度为1500bp，GenBank登录号为KF668096，通过与NCBI中模式菌株的16S rDNA序列比对分析和系统发育树的构建，JL1菌株与青枯劳尔氏菌（Genbank登录号为FJ494776）同源性最近，相似性为99%，16S rDNA序列分析结果，JL1菌株为青枯劳尔氏菌（图4）。

图4 菌株JL1系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strains jumpers JL1

3.5 菌株的回接与再分离

菌株的回接试验表明，烟苗表现典型的青枯病症状：茎上一侧褐色坏死条斑，病侧部分根系变黑腐烂，下部叶片黄化萎蔫。病苗样品在TTC培养基上分离得到典型青枯劳尔氏菌菌落。经过对16S rRNA序列同源性分析，表明该病菌属于青枯劳尔氏菌。

4 结论与讨论

烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌Ralatonia solanacearumE.F Smith（曾用名Pseudomonas solanacearumSmith[2]，或Burkholderia solanacearum，1996年由IJSB正式更名为青枯劳尔氏菌[12]）引起的一种土传病害[8]。是一种高温高湿型病害，低温高湿或高温干旱都不能使病害发生和流行。发病最适宜的温度为30℃～35℃。湿度是影响该病发病流行的另一重要因素。雨量多湿度大，病害发展快，为害重，相反雨量少，湿度低，病害发展受到抑制，为害相对较轻。烟株一旦染病常造成整株死亡，其危害往往是毁灭性的，因此，给烟草生产造成重大经济损失[2,9-11]。

在2010～2013年全国烟草有害生物第二次调查时，在陕南3个烟区首次发现烟草青枯病，调查还发现该病在陕西6月上旬开始发病，7月中旬盛发，时雨时晴的闷热天气病情发展较快，随温度升高而加剧。通过对典型病株的病原进行分离、纯化、回接、显微形态观察、生理生化测定以及16SrDNA序列测定表明，该细菌属于青枯劳尔氏菌，短杆状，大小为1.56—2.28×0.59—0.91μ，在肉汁培养基上，菌落为圆形，稍突起，乳白色有光泽，在TTC培养基上，菌落中央呈粉红色，周围乳白色，流动性强。生理生化特性研究表明，产酸不产气，可使石蕊牛乳胨化，不能使明胶液化，不能还原硝酸盐，产氨不产吲哚，能产生乙酰甲基醇和硫化氢，不能水解淀粉。

将菌悬液接种于健康烟草茎基部，茎均发病，且致病性较强，说明该致病菌对烟草危害较大，若不及时防治，将会对烟草造成毁灭性的危害。本文通过对烟草青枯病在陕西的发生情况、症状、病原鉴定进行了系统研究，为下一步防治烟草青枯病提供了理论依据。

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Identification of tobacco bacterial wilt pathogen in Shaanxi

CHENG Julong1,LUO Jing2,ZOU Hang2,KE Meifu1,NIU Yude1,AN Derong2

1 Shaanxi Provincial Tobacco Company,Xi’an,710061,China;
2 State Key Laboratory of Crop Biology Adversity in Arid Regions,Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling,Shaanxi 712100,China

Tobacco bacterial wilt in Shaanxi was investigated using samples typical of wilt symptoms.Results showed that bacterial wilt occurred in tobacco growing areas of southern Shaanxi province including Hanzhong,Ankang and Shangluo.No bacterial wilt disease was observed in other tobacco growing areas such as Yan'an,Baoji and Xianyang.It broke out in early June and prevailed in the middle of July,indicating that it aggravated in line with rising temperature( with incidence of up to 24.67%).Morphology observation,pathogenicity determination,physiological and biochemical identification in combination with 16S rDNA sequence analysis showed that the pathogen wasRalatonia solanacearum.

tobacco bacterial wilt; identification of pathogen;Ralatonia solanacearum

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.05.014

S43 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）05-0087-06

陕西烟草有害生物调查（KJ-2010-04）

成巨龙（1959—）研究员，主要研究方向为烟草病害，Tel：029-85466136，Email：julongc@126.com

2013-09-22