血管生成素样蛋白基因1和2（ANGPTL1、2）在多囊卵巢综合征患者卵丘颗粒细胞上的表达

薛茜文，黄鑫，郝翠芳＊

（1.山东青岛大学医学院，青岛 266021；2.山东烟台毓璜顶医院生殖医学中心，烟台 264000）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄妇女最常见的内分泌代谢紊乱性疾病之一，发病率高达5%～10%［1］，也是女性无排卵性不育的常见原因，临床表现高度异质性，表现为：月经紊乱，无排卵或稀发排卵，雄激素过多，不少患者伴有胰岛素抵抗，导致高胰岛素血症［2］。PCOS患者无排卵或稀发排卵的主要原因是优势卵泡的募集过程障碍。卵泡的发育成熟的全过程涉及到较多的激素调节、信号转导及血管形成。卵丘细胞与卵母细胞之间复杂的“对话机制”在卵泡成熟过程中起着重要的作用，并对受精及胚胎的发育过程有着一定的影响［3］。卵泡的成熟过程遵循减数分裂，分为胞核和胞质两方面的成熟。卵的核成熟可以分为三个时期：germinal vesicle（GV）、metaphase I（M I）和 metaphaseⅡ （MⅡ）［4，5］。在核成熟过程的终极阶段，卵通过排出第一极体（PB）进入MⅡ期，达到成熟期，进而才有可能能完成正常受精［6］。

血管生成素样蛋白1和2（ANGPTL1和ANGPTL2）隶属于血管生成素样蛋白家族成员，参与调节血管的发生。在内皮细胞表面，ANGPTL1和ANGPTL2通过未知受体发挥作用来调节血管生成，根据所处的环境不同，可能是促进血管生成，也可能是抑制血管生成［7］。ANGPTL1 和ANGPTL2均是通过磷脂酰肌醇3－激酶途径（PI3－K）／Akt途径发挥作用，并且他们的共同活性很有可能在斑马鱼胚胎发育的过程起重要作用［8，9］，但是关注点却在斑马鱼上，并未在人类身上展开其相关研究。有研究［10］证实，卵泡液中 ANGPT1和ANGPT2水平的改变很有可能与排卵前卵母细胞的发育有关。有研究［6］采用基因芯片技术证明，比起MⅠ时期的卵母细胞，MⅡ时期卵母细胞的卵丘颗粒细胞（CC）上ANGPTL1基因的高水平表达，进一步说明了ANGPTL1亦在基因水平参与卵泡的发育，但是并未筛选到基因ANGPTL2。近来越来越多的文献开始倾向于研究不同卵母细胞成熟期（GV、MⅠ、MⅡ）对应的 CC上不同的基因的表达［6，11］，并且不仅仅局限于壁层或黄体颗粒细胞［12］。

本文采用实时荧光定量聚酶链反应（qRTPCR）来研究经过促排卵周期治疗的PCOS患者的MⅡ时期的CC上ANGPTL1和ANGPTL2基因的差异性表达。通过与非PCOS（non－PCOS）患者MⅡ时期CC上相应基因的表达进行定量分析，进而充分把握存在于PCOS和non－PCOS患者间控制卵核成熟的分子机制。

资料和方法

一、患者的选择

收集2013年1月～6月在烟台毓璜顶生殖中心就诊的PCOS患者38例作为实验组，PCOS的诊断均符合鹿特丹诊断标准［2］，具备以下特征：长期稀发排卵或无排卵，雄激素分泌过多和多囊卵巢等特征，并排除库欣综合征、先天性肾上腺增生及一些分泌雄激素的肿瘤；另选取同期相同年龄段因男方因素不育就诊的non－PCOS患者42例为对照组，且妇女月经周期规律及内分泌均正常。本研究经本院临床研究伦理委员会批准，所有实验对象均满足以下特征（表1），且均签署相关知情同意书。

表1 临床患者指标（ ±s）

表1 临床患者指标（ ±s）

注：与non－PCOS组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 n 年龄（岁）BMI（kg／m2）基础LH／FSH基础睾酮（nmol／L）AFC（个）总rFSH（IU）受精率（%）Non－PCOS 42 31.5±2.5 22.6±3.7 4.5±0.6 0.87±0.52 18.2±6.8 1，771.9±20.3 64.0±1.8 PCOS 38 32.6±0.4 23.1±3.2 0.9±0.3＊＊ 1.32±0.49＊ 26.8±8.0＊ 1，375.0±19.4＊68.3±8.0

二、主要试剂和仪器

RNA的提取采用 Qiagen RNeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国），RNA测定采用电泳仪和电泳槽（BIO－RAD，美国），TRANSILLUMINA70R，BINTA 2020D凝胶成像系统（北京华兴科仪科技公司），实时荧光聚合酶链反应试剂盒［TaKaRa Biotechnology（Dalian）Co.Ltd，日本］和逆转录仪（BIO－RAD T100TMThermal Cycle，美国），荧光定量 PCR采用 LightCycler（Roche Diagnostics，Mannheim，德国）和 Rotor Gene 3000system（Corbett，澳大利亚）。

三、方法

1.超排卵方案：根据文献［3，13］，所有患者均采用长方案促排卵：在黄体中期开始给予促性腺激素释放激素激动剂（GnRH－a，Diphereline，Ipen，Pharma Biotech，法国），0.05mg／d 皮下注射，持续到14d，若测得血清雌二醇（E2）＜30pg／ml（109.80pmol／L）、LH＜5IU／L，则可以确定已达到降调节的理想状态，此时再给予重组人促性腺激素 （rFSH，Gona－f，Follitropin Alfa，Serono，瑞 士）（159.97～237.30IU／d）进行启动，阴道超声示有2个以上卵泡直径＞18mm，测血清E2＞300pg／ml（1，098pmol／L）并有1个主导卵泡时，当晚9：00左右给予人绒毛膜促性腺激素（HCG，Profasi，Serono，瑞士）10，000IU 肌肉注射。36h后，阴道超声引导下取卵。

2.CC的处理与分类：取出的卵丘－卵母细胞复合物（COCs）浸于IVF－3.0培养液（Qiagen，Hilden，德国）中，显微镜下用5ml注射器的细针将CC从邻近的卵母细胞上进行剥离，将每一个卵母细胞对应的剥离下来的CC收集在一个盛有80μl Buffer裂解液（RNeasy Minikit，Qiagen，Hilden，德国）的微量离心管（Eppendorf）中。冻存于－80℃冰箱，实验备用。选取成熟的MⅡ期卵母细胞对应的卵丘颗粒细胞（CCMⅡ）共300个（PCOS－CCMⅡ＝148个，non－PCOS－CCMⅡ＝152个）样品进行分组，所有的实验对象可以分为以下6 组：PCOS－CCMⅡ－1，CCMⅡ－2， CCMⅡ－3， Non－PCOS－CCMⅡ－1， CCMⅡ－2，CCMⅡ－3，每组大约45～55个CC样品并保持统一。

3.RNA的提取及逆转录（RT）反应：RNA的提取按照试剂盒（RNeasy Minikit，Qiagen，德国）的说明进行。将所提取的RNA马上取4μl进行琼脂糖凝胶电泳，符合测定标准后，从每组样品中提取大约140～150ng RNA样品加入到逆转录仪的10μl体系中进行逆转录反应，操作按照PrimeScript RT regent kit（Perfect Real time）（TaKaRa，日本）的说明书进行，温度设置如下：37℃15min，85℃5s，4℃5min。

4.实时荧光定量聚合酶链反应（qRT－PCR）：引物序列根据Genebank上所查的序列，由上海生工公司合成。引物序列如下，目的基因：ANGPTL1forward，5’TGGGAGGTAACGAGATTCAGAG 3’，ANGPTL1reverse，5’GCTTCTTTTGCTTGCTGACAGT3’；ANGPTL2forward，5’GGCTCGCCAAG－AGAGAGTTCAT3’，ANGPTL2reverse，5’TTCATGTTGCGGCTCTCCTT3’；内参基因：GAPDH forward，5’TGTTGCCATCAATGACCCCTT 3’，GAPDH reverse，5’CTCCACGACGTACTCAGCG3’。从逆转录过来的每份cDNA样品中吸取2μl进行10μl体系的扩增反应，反应按照LightCycler（Roche Diagnostics，Mannheim，德国）和Rotor Gene 3，000system（Corbett，澳大利亚）说明书进行：95℃预热30s；循环温度如下：95℃持续5s，60℃持续20s，在20℃时选择荧光FAM／SYBER，持续40个循环；溶解曲线温度：65℃持续15s。总体反应持续大约1h，运算分析最终所得CT值。

四、统计学分析

将qRT－PCR 所得的 CT 值按照公式 2－ΔΔCT［14］进行运算，所得的值采用SPSS17.0统计软件进行独立样本t检验，P＜0.05具有统计学差异。

结 果

一、CCMII中ANGPTL1mRNA的表达

PCOS和non－PCOS患者的CCMII中均有ANGPTL1mRNA的表达，且PCOS组中的表达量低于non－PCOS 组的表达量，即PCOS 组ANGPTL1mRNA的表达量约是 non－PCOS的（0.83±0.16）倍，ANGPTL1mRNA 在 non－PCOS患者的CCMII的表达是上调的，但无统计学差异（P＞0.05）（图1）。

图1 ANGPTL1在PCOS患者的CCMII上表达

二、CCMII中ANGPTL2mRNA的表达

PCOS和non－PCOS患者的CCMII中均有ANGPTL2mRNA的表达，且PCOS组中的表达量高于non－PCOS组的表达量，即 PCOS 组ANGPTL2mRNA的表达量约是 non－PCOS的（1.99±0.23）倍，ANGPTL2mRNA 在PCOS患者的CCMII的表达是上调的，与non－PCOS相比，有统计学差异（P＜0.05）（图2）。

图2 ANGPTL2在PCOS患者的CCMII上呈显著性高表达

讨 论

人类的卵泡发育是一个有序的复杂过程。在卵巢组织中，始基卵泡在激素的作用下开始募集生长，最终仅有一个优势卵泡得以排卵，达到成熟状态，完成随后的受精及胚胎发育。在此过程中，卵母细胞分泌的细胞因子参与颗粒细胞的增长和延伸过程。CC中的某些基因的表达调控着卵母细胞的减数分裂及胞核成熟［15］，这些基因大多与卵泡内应激反应如缺氧、营养供应不足、细胞凋亡有关［16］。卵丘CC起源于壁层颗粒细胞（granulosa cell，GC）。在哺乳动物中，颗粒细胞与卵丘颗粒细胞，卵丘颗粒细胞与卵丘颗粒细胞，卵母细胞与卵丘颗粒细胞之间存在着广泛的缝隙连接，因此卵母细胞与卵丘颗粒细胞复合物（COCs）之间靠着丰富的缝隙连接进行着丰富的信号交流，从而达到一个内环境的稳态。同时也可以看出卵母细胞与CC之间有着最直接的联系。因此，通过研究CC上基因的表达特点来间接反映卵母细胞的发育特点。选择CC入组研究的另一个原因是比起GC，CC的同源性较高，研究所用的GC经常混有白细胞、淋巴细胞及其他膜层细胞的污染［13］。组织及细胞的同源性对于控制实验对象的一致性是十分重要的。而且其他因素如：卵母细胞均为体内成熟，均用rFSH，且PCOS患者（1，375.0±19.4IU）低于non－PCOS（1，771.9±20.3IU）患者，以防卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）。

PCOS导致的高雄激素血症、高胰岛素血症及许多与血管发生密切相关的细胞因子的改变，严重扰乱了卵巢内环境的稳定。PCOS患者紊乱的卵丘细胞－卵母细胞信号降低了卵母细胞的发育潜能［17］。PCOS严重影响了育龄妇女的生活质量，其肥胖及胰岛素代谢异常的异质性表现，亦是代谢综合征的临床表现，均有可能导致2型糖尿病和冠状动脉血管性疾病。随着分子生物学的发展，人们逐渐从分子层面入手，展开对PCOS的相关基因的研究。如PCOS患者的CC上表达的基因比non－PCOS的差异性校大，具体说来，PCOS患者的CC上异常表达最明显的是许多生长因子类的基因，包括：表皮生长因子类似物，如表皮生长因子受体（EGFR）、表皮调节素（EREG）、双调蛋白（AREG）和胰岛素样生长因子受体1和2（IGF－1R、IGF－2R），它们参与卵母细胞的成熟过程。在PCOS患者的CC上，与类固醇代谢有关的基因下调，同时还发现在PCOS患者中，转录生长因子受体及孕激素受体两条信号途径的异常调节［18］。有研究发现，在Bmp15－1－和Gdf9＋／－ 双重基因突变小鼠的 CC中，胆固醇合成过程中酶的转录水平下降，严重影响了排卵前CC中的胆固醇代谢及糖酵解过程［19］。

卵泡的发育过程离不开大量血管的发生来提供充足的营养。血管生成素样蛋白（angiopoietinlike proteins，ANGPTLs）与血管的发生密切相关。ANGPTLs包含有7个家族成员，ANGPTL1～7，由7个同名的基因编码而成。ANGPTLs结构上与血管生成素（angiopoietins，ANGPTs）高度同源，具有一个卷曲－卷曲样区域（coiled－coiled district，CCD）和一个受体结合区域（fibrinogen－like district，FLD）［7，20，21］。由于ANGPTLs既 不 与 TIE1结合，也不与TIE2结合，因此被誉为孤立配体，只是结构与功能上和ANGPTs高度同源，所以被称为ANGPTLs或血管生成素相关蛋白（angiopoietin related proteins，ARP）［9］。有研究［22］显示，ANGPTLs的活性不仅仅局限于脉管系统，同时也体现在其他组织中。有研究显示，ANGPTL1、2在小鸡胚胎移植前的子宫中高表达，证明了其参与了细胞外基质的重塑和血管发生过程。先前的关于ANGPTL1、2的研究较多地仅关注于其血管发生作用，如ANGPTL1、2在内皮细胞表面通过未知受体来调节血管发生，具体是促进还是抑制血管生成，主要取决于所处的周围的环境而定［7］，并且二者可能是通过PI3－K／Akt信号途径参与斑马鱼的胚胎发生过程［8，9］。目前就ANGPTLs在调节卵泡发育的报道较少见。近年来，关于ANGPTL2在脂质代谢方面的研究逐渐增多。在脂肪组织中，AN－GPTL2能够介导慢性脂肪组织炎症的发生，促进肥胖相关的胰岛素抵抗［23］。然而也有研究恰恰相反，ANGPTL2喂养小鼠的血浆中，血糖、胰岛素、甘油三酯（TG）水平下降，说明了ANGPTL2在2型糖尿病不同时期发挥的不同作用［24］。本研究结果显示，ANGPTL2在PCOS患者的CCs上高表达，其表达量约是non－PCOS患者的1.99倍（P＜0.05），提示ANGPTL2可能参与了PCOS致病的发生。虽然实时荧光定量的比值未＞2，但差异性是存在的。ANGPTL1在PCOS患者的CCs上低表达，但差异也无统计学意义，提示ANGPTL1的表达可能与PCOS这种疾病状态无关。造成ANGPTL1、2的这种的表达的差异也有可能是本实验中两组患者的特异性差异。但两组体重指数（BMI）比较无统计学意义，所以需要大量的实验来验证ANGPTL1、2与PCOS这种疾病的确切相关性。但是比较明确的一点是，相比ANGPTL1，ANGPTL2与PCOS卵母细胞的发育有着更紧密的相关性，其可能参与了PCOS的致病过程，引起卵巢内及其周围脂质代谢的异常，从而影响卵泡的正常发育。

PCOS的发病机制很复杂，由于其病因不清楚，所以目前仍缺乏理想的治疗方法。本实验通过研究ANGPTL1、2在PCOS患者CC上的表达，探讨ANGPTLs与PCOS的相关性，不仅有助于深入理解PCOS的发病机制，同时也为PCOS的治疗提供新的思路和药物治疗的靶点。

［1］Wei Z，Cao Y，Cong L，et al.Effect of metformin pretreatment on pregnancy outcome of in vitro matured oocytes retrieved from women with polycystic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，2008，90：1149－1154.

［2］The Rotterdam ESHRE／ASRM－Sponsored PCOS Consensus Workshop Group.Revised 2003consensus on diagnostic criteria and long－term health risks related to polycystic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，2004，81：19－25.

［3］Huang X，Hao C，Shen X，et al.Differences in the transcriptional profiles of human cumulus cells isolated from MI and MII oocytes of patients with polycystic ovary syndrome［J］.Reproduction，2013，145：597－608.

［4］Cha KY，Chian RC.Maturation in vitro of immature human oocyte for clinical use［J］.Hum Reprod Update，1998，4：103－120.

［5］Marteil G，Richard－Parpaillon L，Kubiak JZ，et al.Role of oocyte quality in meiotic maturation and embryonic development［J］.Reprod Biol，2009，9：203－224.

［6］Ouandaogo ZG，Frydman N，Hesters L，et al.Differences in transcriptomic profiles of human cumulus cells isolated from oocytes at GV，MI and MII stage after in vivo and in vitro oocyte maturation［J］.Hum Reprod，2012，27：2438－2447.

［7］Dhanabal M，LaRochelle WJ，Jeffers M，et al.Angioarrestin：an antiangiogenic protein with tumor－inhibiting properties［J］.Cancer Res，2002，62：3834－3841.

［8］Kubota Y，Oike Y，Satoh S，et al.Cooperative interaction of Angiopoietin－like proteins 1and 2in zebrafish vascular development［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102：13502－13507.

［9］Kubota Y，Oike Y，Satoh S，et al.Isolation and expression patterns of genes for three angiopoietin－like proteins，Angptl1，2and 6in zebrafish［J］.Gene Expr patterns，2005，5：679－685.

［10］Nishiqaki A，Okada H，Tsuzuki T，et al.Angiopoietin 1and angiopoietin 2in follicular fluid of women undergoing a long protocol［J］.Fertil Steril，2011，96：1378－1383.

［11］Quandaogo ZG，Haouzi D，Assou S，et al.Human cumulus cells molecular signature in relation to oocyte nuclear maturity stage［OL］.PLoS One，2011，6：e27179.

［12］王影，魏兆莲，曹云霞.CHOP／GADD153在多囊卵巢综合征患者卵巢黄体颗粒细胞上的表达［J］.生殖与避孕，2012，32：306－310.

［13］Kenigsberg S，Bentov Y，Chalifa－Caspi V，et al.Gene expression microarray profiles of cumulus cells in lean and overweight obese polycystic ovary syndrome patients［J］.Mol Hum Reprod，2009，15：89－103.

［14］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2（－Delta Delta C（T））method［J］.Methods，2001，25：402－408.

［15］Eppig JJ.Maintenance of meiotic arrest and induction of oocyte maturation in mouse ooctye－granulosa cell complexes developed in vitro from preantral follicles［J］.Biol Reprod，1991，45：824－830.

［16］Corn CM，Hauser－Kronberger C，Moser M，et al.Predictive value of cumulus cell apoptosis with regard to blastocyst development of corresponding gametes［J］.Fertil Steril，2005，84：627－633.

［17］Dumesic DA，Abbott DH.Implications of polycystic ovary syndrome on oocyte development［J］.Semin Reprod Med，2008，26：53－61.

［18］Haouzi D，Assou S，Monzo C，et al.Altered gene expression profile in cumulus cells of mature MII oocytes from patients with polycystic ovary syndrome［J］.Hum Reprod，2012，27：3523－3530.

［19］Su YQ，Sugiura K，Wigglesworth K，et al.Oocyte regulation of metabolic cooperativity between mouse cumulus cells and oocytes：BMP15and GDF9control cholesterol biosynthesis in cumulus cells［J］.Development，2008，135：111－121.

［20］Kersten S，Mandard S，Tan NS，et al.Characterization of thefasting－induced adipose factor FIAF，a novel peroxisome proliferator－activated receptor target gene［J］.J Biol Chem，2000，275：28488－28493.

［21］Koishi R，Ando Y，Ono M，et al.Angptl3regulates lipid metabolism in mice［J］.Nat Genet，2002，30：151－157.

［22］Scott CA，van Huyen D，Bany BM，et al.Angiopoietin－like gene expression in the mouse uterus during implantation and in response to steroids［J］.Cell Tissue Res，2012，348：199－211.

［23］Lee HJ，Kim JH，Martinus RD，et al.Angiopoietin－like 2，a chronic inflammatory mediator，is a new target induced by TGF－β1through a Smad3－dependent mechanism［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，430：981－986.

［24］Kitazawa M，Naqano M，Masumoto KU，et al.Angiopoietinlike 2，a circadian gene，improves type 2diabetes through potentiation of insulin sensitivity in mice adipocytes［J］.Endocrinology，2011，152：2558－2567.