恐惧应激大鼠行为学评估及比较*

董秋安 刘晓伟

（同济大学附属同济医院·上海 200065）

随着社会发展的加快，竞争压力逐步增大，人类疾病谱发生了很大的变化，各种因社会、心理或行为因素所致疾病急剧上升，心理过度应激导致的精神类疾病层出不穷。有资料显示，我国70%的人处于亚健康状态，与心理应激相关的疾病患者约占人群的5%～10%，身心疾病、心理障碍已成为多发病、常见病。目前，对心理疾病及心理应激的基础和临床研究已经成为医学研究重要课题之一。本实验根据中医七情理论，参照Takashi[1]方法建立恐惧应激模型，观察并评估其行为学变化，为探索中医情志病证模型制作的思路与方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性Wistar大鼠，体重180～220g，购自南方医科大学实验动物中心（动物合格证号：粤检证字2002A041号）。室温22～26℃安静环境下饲养。动物分组：正常对照组、恐惧模型组、孤独饲养组，每组8只。

1.2 模型制作方法

恐惧模型组：大鼠单独饲养于不锈钢笼中（50cm×30cm×20cm），自由饮食饮水，饲养10天，第11天13：30将大鼠单独放入光电刺激仪（30cm×40cm×40cm），四周为玻璃，底部铺设铜栅，通以1mA交流电，顶部置10W日光灯）；前5min为适应期，后同时给予电击和闪光，每次1S，间隔1min，共30次。第12，13天重复实验。第14天实验只予光照，不予电击，摄像记录第6min－30min内大鼠行为变化，实验结束立即放入旷场实验箱内，进行应激后行为学检测。

孤独饲养组：大鼠于同样环境下孤独饲养10天，第14天13：30摄像记录大鼠行为变化，并对其行为学进行评分，14：00放入旷场实验箱内，进行应激后行为学检测。

同样环境下，正常对照组大鼠予以群居饲养，自由饮食饮水，第14天进行行为学测定及旷场实验，步骤及时间同孤独饲养组。本实验中动物抓取要求动作特别轻柔，避免不必要的刺激干扰实验结果。

1.3 试剂和仪器

SONY.DCR-TRV9E数码摄像机（日本），旷场实验箱（100cm×100cm×50cm）。

1.4 行为学变化观察

恐惧模型组大鼠行为学检测[2]：恐惧模型组大鼠在闪光照射后出现冻结姿势（freezingposture）：静止、呆滞、蜷缩、蹲伏等，期间仅有呼吸和轻微摇摆运动。其总时间称为冻结时间（freezingtime），即恐惧模型组大鼠行为得分。行为评定采用盲法，单位以秒来计算，由3名观察者观看录像后评分，取其平均值。三者评定一致性很高（大于0.95）。

应激后旷场行为学检测[3]：将动物置于100cm×100cm×50cm，周壁为黑色，底面分成面积相等的25方格的旷场里。摄像记录动物3min的行为，以穿越底面的格子数为水平活动得分，以直立的次数为垂直活动得分，旷场实验得分为两者之和。行为评定采用盲法，由3名观察者观看录像后评分，取其平均值。三者评定一致性很高（大于0.95）。

1.5 统计学处理

实验结果用spss13.0统计软件分析，均用X—±s表示，利用Pearson相关分析旷场两变量之间的关系，采用单因素方差分析方法（One-Way-ANOVA）进行多样本均数比较，若存在差异，采用Levene检验进行方差一致性检验，若方差齐时，用Least-significantdifference（LSD）方法，若方差不齐时用Tamhane’sT2方法。P＜0.05被认为有显著性差异。

2 结果

1.各组大鼠行为学得分

实验开始5min为适应期，恐惧模型组大鼠移动缓慢、贴壁，后蜷缩于角落处。接受闪光照射后表现为静止、呆滞、蜷缩、蹲伏等冻结姿势，期间仅有呼吸和轻微摇摆运动；伴有立毛、肌肉轻微振颤、大小便失禁。三组间行为学得分存在显著差异（F=72.582，P=0.000），恐惧应激大鼠行为学得分高于正常对照组及孤独饲养组（P=0.000）。正常对照组与孤独饲养组比较，无显著差异（P=0.153）。结果见表1。

表1 各组大鼠行为学得分比较（秒，X—±s）Table1：Comparison of praxiology score of each group

2 各组大鼠旷场实验行为学得分

各组大鼠旷场实验得分比较结果：各组大鼠旷场实验水平得分、垂直得分、旷场总分均有显著差异（P＜0.01）。水平得分、垂直得分、旷场总分F值分别为23.893、52.371、40.963；P值均为0.000。恐惧模型组得分低于孤独饲养组和正常对照组，孤独饲养组得分高于恐惧模型组，低于正常对照组（均为P＜0.05）。对垂直得分及水平得分进行Pearson相关分析，Pearson相关系数r=0.730，P＝0.000（双侧），认为水平得分与垂直得分之间存在正相关关系。结果见表2。

表2 各组大鼠旷场实验行为学得分比较（分，Table2：Comparison of open-field score of each group

表2 各组大鼠旷场实验行为学得分比较（分，Table2：Comparison of open-field score of each group

注：与正常对照组相比（vs normal group）：*P＜0.05；与恐惧模型组相比（vsmodelgroup）：#P＜0.05

组别 N 水平得分 垂直得分 旷场实验得分正常对照组 8 32.38±9.04# 8.50±1.20# 40.88±9.54#恐惧模型组 8 10.00±3.21* 1.38±0.74* 11.38±3.07*孤独饲养组 8 24.63±6.14*# 5.13±2.00*#29.75±5.44*#F 23.893 52.371 40.963 P 0.000 0.000 0.000

3 讨论

恐志属中医七情范畴，对恐志的基础及临床研究为七情学说的重要内容。但是由于目前对情感因素有关的脑区定位尚未完全明确，又缺乏相关的动物模型，故目前涉及怒、恐在内的情志基础研究报道并不多。Davis[4][5]发现通过条件反射性恐惧训练（Contextual fear conditioning）的动物，其行为表现与临床焦虑症患者的症状和体征很相似。恐惧条件反射[6]是指在一种明确的中性刺激（一般是光照或声音）与一种恶性刺激（通常是电击足底）之间建立联系，这种联系建立与否可以用木僵行为实验进行检测。Davis等[6]认为，灯光与电击足部引起的惊吓反应增强是一种刺激特异性恐惧。目前条件性恐惧训练已经成为一种经典的诱导焦虑恐惧反应模型的方法，被国外学者所采用。本试验根据经典条件反射原理，试图制作恐惧心理应激动物模型，并对模型进行了量化评定。实验中的恐惧模型根据Takashi[1]方法并改良，通过间断、低频、低压交流电电击大鼠足底，使动物反复受到刺激，结合同步闪光照射，3天后形成条件反射。第4天仅给予闪光照射，大鼠即产生恐惧心理和行为，表现为长时间的静止或蜷卧等。冻结姿势能够客观、有效地反映动物的恐惧情绪水平，其总时间测定与文献报道基本一致[7]。本实验恐惧应激大鼠的行为得分与正常对照组及孤独饲养组比较均有显著差异（F=72.582，P=0.000）,恐惧应激大鼠行为学得分显著高于正常对照组及孤独饲养组，而正常对照组与孤独饲养组比较，无显著差异（P=0.153），说明造模大鼠恐惧情绪水平较高，而单纯的孤独饲养并无此效果。

中医七情理论系统阐述了情绪致病的机理：主要通过扰乱人体的气机升降，导致五脏的气机失调而发病。《内经》中言：“百病先于气也，怒则气上，恐则气下”“忧恐忿怒伤气，气伤脏，乃病证”等，即愤怒、恐惧等情绪，先伤人体的气机，由气机的紊乱进而使五脏受病。“有诸内者，必形诸外”，行为是脏腑气血的外在反映。愤怒、惊恐等情绪在内扰乱气机而致病，在外则表现为行为异常。恐惧主要表现为退缩逃避、惊慌失措、交感神经兴奋（呼吸心跳加快、瞳孔扩大、颤抖），甚至肢体软瘫、大小便失禁或精神抑制等[7]。

旷场实验是比较经典的用于反映动物探究行为及情绪反应的实验方法，能够有效评价动物对新异环境的兴奋性、适应性、探究、紧张、记忆等多种行为。水平得分即动物跨格数，反映动物的兴奋性；垂直得分即动物站立次数，主要反映动物对周围环境的不确定性和探究趋势。这种活动在一定程度上表明了中枢神经系统的兴奋或抑制状态。本实验中各组大鼠旷场实验水平得分、垂直得分、旷场总分均有显著差异（F值分别为23.893、52.371、40.963；P值均为0.000）。恐惧模型组得分显著低于孤独饲养组和正常对照组，孤独饲养组得分显著高于恐惧模型组，低于正常对照组（P＜0.05），说明排除孤独饲养因素，恐惧应激能够使大鼠的兴奋性、敏感性明显减弱。旷场实验水平得分与垂直得分呈显著正相关（r=0.730，P=0.000），说明反映动物相同功能的两指标对应良好，实验的可靠性强。

公认良好有效的情感障碍动物模型应该具有以下特征[8]：行为表现的模拟性（模型与疾病之间症状的一致性）；药效的可预测性；具有合理的理论基础。本实验设计的恐惧应激动物模型尽可能排除躯体刺激的干扰，为相对“纯粹”的情绪模型；后期实验应用药物进行药效预测[9]；同时对动物的行为进行量化评分，更为客观准确。经旷场实验分析，恐惧则减弱大鼠兴奋性及适应能力，这种表现与人的情绪反应有一定程度的相似性，说明此模型能够有效模拟人类恐惧情绪，排除躯体刺激干扰，且量化评定方法直观、可靠，是较为理想的中医情志内伤模型。

[1] Takashi，Takeuchi，Miyoko，Iwanaga，et al.Possible regulatory of DHA-induced antistress reaction[J].Brain research，2003，964：136-143

[2] Alleva,E.Assessment of aggressive behaviour in rodents[J].Methods in Neuroscience，1996，14：111-137

[3] 张红梅,刘晓伟,曲宏达,等.愤怒心理应激动物模型制作与行为评估[J].中国行为医学科学，2005，14：188-190

[4] Davis,M.The role of the amygadala in fearpotentiatedstartl：implication for animal modlesof anxiety[J].Trends Pharmacolsci 1992；13（1）：35-41

[5] Davis,M.The roleof the amygadala in fearandanxiety[J].Annu Rev Neurosci 1992，15：353-75

[6] Davis,M.Are different Parts of the extended amygdala involved in fear versus anxiety?[J].Biol Psychiatry，1998，44：1239-1247

[7] 李慧吉,武成.情志医学的研究[J].天津中医，2000，17：37－39

[8] Willner P.validation criteria for animal models of humanmental disorders：learned helplessness as a paradigm case[J].Prog Neuropsy choparmalol Boil Psychiatry，1986；10（6）：677-690

[9] 董秋安,刘晓伟.惊恐应激大鼠下丘脑单胺类递质变化及中药干预[J].辽宁中医，2006，33（12）：1131-1132