胡子鲇外周血细胞的组成及显微与超微结构

赵莎莎++丁丽军

摘要：采用显微和超微技术对胡子鲇外周血细胞的组成及组织结构进行观察。在血涂片上可辨别出红细胞和各种白细胞，电镜观察可确认这些细胞类型。血涂片上还观察到各个时期的红细胞。白细胞中淋巴细胞数量最多，约占白细胞总数的48.70%，嗜中性粒细胞占24.76%，单核细胞占17.03%，血栓细胞少，约为9.51%。组织结构显示，红细胞为长椭圆形，胞质中未见细胞器。淋巴细胞以大的核质比、短的伪足和较多的胞质液泡为特征。单核细胞特征为可见有少量的伪足、线粒体、核糖体、内质网、胞质液泡以及偏位核。而有粒白细胞根据胞质内颗粒形态，将其分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型颗粒细胞3种类型，Ⅱ型类似于其他鱼类的嗜中性粒细胞，Ⅲ型类似于草鱼中功能衰退的嗜中性粒细胞，Ⅰ型类似于鳜鱼Ⅰ型粒细胞，属于哪种类型尚待进一步研究。

关键词：胡子鲇；血细胞；血细胞分类计数；显微结构；超微结构

中图分类号： S917.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0220-04

收稿日期：2014-04-14

作者简介：赵莎莎（1979—），女，江苏徐州人，实验师，主要从事实验室教学工作。E-mail：157568300@qq.com。一种鱼类完整的血液学资料可以反映机体的生理状态和健康情况，对鱼病的预防和诊断具有一定意义[1]。血液学检查再结合其他常规诊断方法，常用于确定和评估鱼体产生应激进而致病的环境条件[2]。作为鱼类有形成分的血细胞既是鱼类机体的组成部分，也是机体细胞免疫和体液免疫的重要组成部分，在鱼类疾病的预防过程中发挥着重要作用。目前，国内外有关鱼类外周血细胞的研究，已有较多报道，主要集中在鲤鱼、鲇鱼、斑点叉尾、淡水石斑鱼、鲫鱼、黄颡鱼、长吻和军曹鱼[3-10]上。

胡子鲇（Claris fuscus Lacepede）属于硬骨鱼纲（Osteichthyes）鲇形目（Siuriformes）胡子鲇科（Clariide），广泛分布于我国长江以南各水体，其肉质细嫩，营养丰富，适应能力强，经济价值及养殖效益较高，是我国重要的淡水养殖鱼类。有关胡子鲇的研究已有相关报道[11-12]，有关血细胞方面的研究报道较少[13]。本研究以胡子鲇外周血液为材料，利用光镜和电镜技术对其血细胞的组成及其显微与超微结构进行研究，以期为胡子鲇外周血细胞研究提供基础资料，并为其养殖和病害防治提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

20尾体表无伤痕、健康、成熟的胡子鲇购自水产市场，平均体质量1.45 kg，雌雄各占50%。暂养于水族箱里。

1.2试验方法

用盛有抗凝剂的5 mL注射器从鱼尾静脉采血。部分制成血涂片（4张/尾）。经甲醇固定后用Wrights液染色。光镜下观察，进行分类描述，并对80张血涂片上的8 000个白细胞进行分类计数。部分用于血细胞指标的测定。红细胞数（RBC）：用0.9%NaCl溶液将血液稀释100倍，用血细胞计数板在显微镜下计数。白细胞数（WBC）：用2%醋酸将血液稀释10倍，用血细胞计数板在显微镜下计数。部分血液作电镜观察。在加有抗凝剂的1.5 mL离心管中加入1 mL血液，1 000 r/min，离心10 min。除去血清，加入冷的（4 ℃）2%的戊二醛，4 ℃固定1 h。然后将其切成1 mm3的小块，用 0.1 mol/L 的PBS（pH值7.2）液漂洗4次，再用1%锇酸进行固定，漂洗过夜，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，LKB 5型超薄切片机切片（厚度约600×10-10 m），醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色，PHILIPS TECNAI 10型透视电镜观察并拍照。2结果与分析

2.1血细胞计数和各类血细胞大小

3讨论

3.1血细胞的组成与大小

胡子鲇白细胞比例中淋巴细胞数量最多，与日本白鲫、成年草鱼[14-15]相同；与鳜鱼[16]、黄颡鱼[8]、南方鲇[17]等以血栓细胞为最多的鱼类明显不同 。各类白细胞所占比例，相关报道并不一致，主要表现为淋巴细胞（9%～74%）和血栓细胞（5%～72%）所占比例，其他白细胞则因数量较少而所占比例没有大的差异[16]。造成淋巴细胞和血栓细胞比例有差异的主要原因有3个方面：（1）相关学者在计数时没有把血栓细胞算在内，因而淋巴细胞比例显著提高；（2）血涂片上血栓细胞易与淋巴细胞混淆，所以计数时可能造成误差；（3）淋巴细胞对外部环境变化比较敏感，采血时鱼体所处状态不同，造成种间或个体间差异[16]。有关各类细胞大小相关报道基本一致，即血栓细胞和淋巴细胞较小，单核细胞和粒细胞较大。

3.2血细胞形态

鱼类外周血红细胞与哺乳动物的相比，体积大，数量少，具有细胞核，胞质中还有少量细胞器[18]，表明其代谢比较活跃。然而在胡子鲇红细胞胞质中未见到任何细胞器，这可能是由于在制作电镜样品时使用锇酸和戊二醛的双重固定使血红蛋白保存比较完整而掩盖了其他细胞器[19]。胡子鲇外周血中所见到的较幼稚和正在分裂的红细胞，在某些鱼类[18]也有报道，表明鱼类红细胞除了在造血器官中产生外，还可在外周血中通过直接分裂而产生。

在大多数硬骨鱼类中淋巴细胞形态结构基本相似，但不同鱼类其细胞器却存在较大差异。本研究进一步证实该结论的正确性。胡子鲇淋巴细胞胞质的超微结构中看不到细胞器，而在黄颡鱼中有线粒体及大量的游离核糖体[8]，草鱼中有溶酶体、核糖体等细胞器[15]。

单核细胞存在于所有脊椎动物中，起着比较重要的非特异性免疫的作用。鱼类血液中有没有单核细胞及其命名问题，早期报道中存在分歧，但被后来的研究[20]所肯定并统一了名称。胡子鲇的单核细胞与哺乳动物的相似，也有胞质突起，胞质中含有较多的液泡和吞噬物，说明胡子鲇也可进行活跃的变形运动，具有吞噬功能，这在多种鱼类[20-21]得到直接的证实。

血栓细胞是鱼类中具有凝血作用的细胞，在外周血中一般成群分布。胡子鲇的血栓细胞也是如此。Rowley等解释这是由于在制作血涂片时较慢或在此之前血液已有部分凝固导致。胡子鲇的血栓细胞中所含有的电子致密颗粒，在鲮、鲩、鳙、鲢和星鲨[22-23]中均能见到，均认为与哺乳动物血小板中称为血栓颗粒的功能相当。

3.3血细胞种类

在对有粒白细胞的研究中，不同学者对鱼类有粒白细胞的了解也并未统一，主要表现在因分类依据不同而造成命名各异，即使同种鱼类相似的细胞也会被不同研究者解释为不同性质的细胞。在光镜下，一般有粒白细胞可分为3类：嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。一般情况下，嗜中性粒细胞存在于所有硬骨鱼类中，但是嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的存在会因鱼种类而异。Weinreb在金鱼外周血中只见到少量嗜碱性粒细胞[24]。林光华等在100张革胡子鲇的血涂片上仅发现一个嗜碱性粒细胞[25]。南方鲇、花尾胡椒鲷、勒氏笛鲷[26-28]等的外周血中有嗜酸性粒细胞，但未发现嗜碱性粒细胞。而军曹鱼[10]、欧洲鳗鲡[29]等鱼类的外周血中嗜酸性、嗜碱性2种粒细胞均未发现。即使同一种鱼，不同研究者得出的结果也不一致。Willianmms等在斑点叉尾的血液中发现了嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞[30]，而Cannon等在斑点叉尾的血液中2种细胞均未发现[31]。我们对胡子鲇血涂片有粒白细胞的观察也证实嗜中性粒细胞数量较少，在80张血涂片中没有观察到嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。这可能是由于这2种细胞的颗粒易溶于水，导致其被溶解掉。电镜下胡子鲇粒细胞根据其特殊颗粒的结构特征，把其分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。Ⅰ型粒细胞超微结构类似于鳜鱼Ⅰ型粒细胞[16]，相同地方是细胞质内有基本呈圆形大小不等的电子致密颗粒，但其归属还不清楚；Ⅱ型类似于鱼类中的嗜中性粒细胞[15，32]，胞质中有2种类型的颗粒：一种为棒形，内为匀质的基质而外部包有1层被膜，另一种为圆形，膜内基质也较均匀，外包被膜；Ⅲ型粒细胞类似于林光华提出的功能衰退的嗜中性粒细胞[15]，圆形颗粒分散解体而呈空泡化，致使胞质中形成大量空泡，细胞器数量严重减少，细胞表现出退化趋势。

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