SIRT1 mRNA在C2C12成肌细胞增殖过程中的时相性变化

李方晖

（肇庆学院 体育与健康学院，广东 肇庆 526061）

骨骼肌卫星细胞(satellite cell,SC)是位于骨骼肌纤维的肌膜和基底膜之间的一种肌源性干细胞.SC所具有的再生及分化多潜能功能使其在骨骼肌损伤修复和可塑性方面起到关键性作用[1].在骨骼肌损伤的再生修复过程中,机体可通过自分泌和旁分泌的方式分泌生长因子，后者通过调控细胞内信号蛋白酶表达来实现对SC激活、分裂、增殖的控制.目前关于SC增殖过程中细胞应激蛋白酶的表达变化规律的研究较少.本研究从与SC增殖关系密切的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶1(sirtuin1，SIRT1)入手，通过体外细胞培养技术培养小鼠C3H骨骼肌成肌细胞系(C2C12)，采用MTT比色法测定细胞的增殖活性，运用实时荧光定量–聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测细胞增殖过程中SIRT1 mRNA的时相性表达,为进一步探讨SC增殖影响因素，了解SC的生物特性，更好地利用影响因素指导临床对骨骼肌损伤的治疗，提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 细胞培养及处理

将含双抗(青霉素100mg/mL、链霉素100mg/L)和10%胎牛血清(FBS)(杭州四季青)、22.5mmol/L D-葡萄糖的(DMEM)(Hyclone)培养液，置于含5%二氧化碳(CO2)、37℃的细胞培养箱中培养.细胞传代常规胰酶消化，注意消化时间不宜过长，按1：3传代，隔天换液.

1.2 指标测试

1.2.1 骨骼成肌细胞标准曲线和生长曲线

将生长良好的C2C12成肌细胞(中国科学院上海细胞库)制成细胞悬液，取对数生长期细胞，以2×103个细胞接种于96孔板，细胞生长汇合后1～2 d开始实验.取接种培养1 d的96孔板分别在移殖后1～5 d进行MTT检测.具体步骤：加入10μL每孔5.00 g/L的MTT，37℃孵育4 h，不吸出培养基直接加入甲瓒裂解液100μL每孔，继续置CO2培养箱内孵育4 h至甲瓒全部溶解，于微量振荡器上轻轻震荡混匀，用酶标仪(BIO-RAD550型，美国)测定570/655 nm处的吸光度值(OD值).每次实验重复3次.根据拟合的标准曲线计算细胞数目.

1.2.2 信使核糖核酸提取和检测

分别在移殖后1～5 d收取细胞样品，用RT-PCR检测SIRT1、甘油醛–3–磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA表达.去除培养皿中细胞培养液,用Trizol一步法提取总核糖核酸(RNA)，反转录和荧光定量聚合酶链式反应均参照试剂盒说明书(TaKaRa),引物见表1.反应条件:预变性(95℃,20 s);40个PCR循环(95℃,5 s;60℃，20 s，收集荧光),扩增反应结束后,再变性(95℃,75s),退火(55℃,60 s),然后从55℃缓慢加热到95℃,15 s;每1℃收集荧光.结果表明,熔解曲线只显示一个主波峰.说明PCR扩增的特异性较高,符合荧光定量PCR的技术要求(如图1).反应结束后,RT-PCR仪给出各反应孔的Ct值,以GAPDH基因为内参,根据公式2-△△Ct计算各样品目的基因的相对表达量.

表1 用于实时荧光定量PCR的引物序列一览表

图1 SIRT1基因PCR的扩增曲线(a)和溶解曲线(b)

1.3 统计学处理

实验数据由SPSS 18.0统计软件处理.结果以平均值和标准差(M±SD)表示,同一指标不同组间进行方差分析,统计学显著性水平定为P<0.05，OD值与SIRT1 mRNA表达量之间进行相关性分析.

2 结果

2.1 体外培养C2C12成肌细胞的生长特性

图2显示，接种后由于细胞的贴壁和伸展，潜伏期为1～2 d.接种后第3天的细胞增殖活性与第1和第2天都有显著性差异(P<0.05)，第4天和第5天与第1和第2天相比都有极显著性差异(P<0.01).这说明，骨骼肌卫星细胞自接种后第3天进入对数生长期，至第5天开始进入到平台期.加入MTT溶液之前观察细胞形态，发现已有部分骨骼肌卫星细胞开始相互融合形成肌管细胞.

2.2 SIRT1 mRNA表达

图3结果显示：与第1天相比,尽管第2天的SIRT1 mRNA表达增加1.5倍，但没有显著性差异(P>0.05)；第3天增加了1.8倍(P<0.05)；第4天和第5天分别增加2.3和2.4倍(P<0.01).此外，与第2天相比，第4天和第5天SIRT1 mRNA表达也分别增加1.5和1.6倍(P<0.05).

图2 C2C12成肌细胞体外培养的生长曲线

图3 C2C12成肌细胞SIRT1 mRNA表达的时相性

2.3 相关性分析

将细胞增殖的OD值和3个基因的mRNA进行相关分析发现，SIRT1 mRNA相对表达水平与细胞增殖活性呈中度正相关(R2=0.873；P=0.02)(见图4).

3 讨论

图4 C2C12成肌细胞的增殖活性(OD值)和SIRT1 mRNA相关性

第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶1(SIRT1)作为应激因子，可通过调控细胞多种生理功能延长寿命[2].研究表明，SIRT1可调控成肌细胞生理功能，如增殖和分化[3-6].MCBURNEY MW等[3]通过敲除SIRT1基因发现，大鼠肌卫星细胞增殖活性削弱.衰老个体成肌细胞增殖活性降低可能与SIRT1活性降低有关[4].LIFanghui等[5]研究发现，SIRT1 mRNA表达减少跟高糖诱导的C2C12成肌细胞增殖功能紊乱相关.与高糖培养类似，高氧(20%)也能导致成肌细胞增殖功能失调.RATHBONE等[6]研究发现SIRT1表达减少介导高氧诱导的肌卫星细胞增殖抑制作用.直接补充SIRT1小分子活性物质白藜芦醇能促进高氧条件或高糖环境下的成肌细胞增殖[6].提示成肌细胞增殖失调与SIRT1表达下调有关.

本文进一步研究了C2C12成肌细胞正常增殖过程的中SIRT1 mRNA表达后发现：前2 d增殖潜伏期的SIRT1表达是稳定的，尽管稍微有所增加，但不具有显著性差异;第3天后SIRT1 mRNA表达出现递增趋势.前人研究也发现，潜伏期单个细胞分裂周期过程中的2～18 h SIRT1表达是稳定的[7]，第3 d后细胞增殖进入对数期，细胞增殖速度加快.增殖速度越快势必导致细胞内的DNA复制速率越快,DNA复制过程的错误率就会增加.由于SIRT1具有维持基因组的功能稳定[7]和端粒酶活性[8]的作用，因此，SIRT1表达增加刚好配合对数增殖期的细胞增殖速度，进而维持增殖稳定性.图4显示C2C12成肌细胞整个增殖过程与SIRT1 mRNA表达有中度的相关性.这也得到了成纤维细胞研究的佐证[8].增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是评价细胞增殖状态的重要指标.成纤维细胞研究发现，SIRT1蛋白表达与PCNA成中度正相关[8].人胚胎干细胞增殖潜能强于诱导多潜能干细胞来源的血管内皮细胞，而后者强于正常成人血管内皮细胞.研究也发现，这3种细胞增殖潜能的高低是由SIRT1表达决定的，人胚胎干细胞SIRT1表达最高，诱导多潜能干细胞来源的血管内皮细胞次之，成人血管内皮细胞最低[9].这也间接说明了SIRT1表达跟不同类型细胞增殖活性成正相关.

[1]YEL,LEEK O,SU L P,et al.Skeletal myoblast transplantation for attenuation of hyperglycaemia,hyperinsulinaemia and glu cose intolerance in a mouse model of type2 diabetes mellitus[J].Diabetologia,2009,52(9):1925-1934.

[2]李方晖,曹伟,赵军,等.Sirtuins去乙酰化酶的功能及其在体育科学中的应用[J].体育学刊，2011,18(6):138-144.

[3]MCBURNEY M W,YANG X,JARDINEK,et al.The absence of SIR2alpha protein has no effect on global gene silencing in mouse embryonic stem cells[J].Mol Cancer Res,2003,1(5):402-409.

[4]MACHIDA S,BOOTH FW.Insulin-like growth factor 1 and muscle growth:implication for satellite cell proliferation[J].Proceedingsof the Nutrition Society,2004,63,337-340.

[5]LI Fanghui,WEI Enxiu,LIU Yanying,et al.PI-3K mediated modulation of red light and resveratrol on high glucose induced dysfunctional myoblasts[J].Lasers Surg Med,2011,43(S23):54-55.

[6]RATHBONE C R,BOOTH F W,LEESSJ.Sirt1 increases skeletal muscle precursor cell proliferation[J].Eur JCell Biol,2009,88(1):35-44.

[7]YUAN J,PU M,ZHANG Z，et al.Histone H3-K56 acetylation is important for genomic stability in mammals[J].Cell Cycle,2009,8(11):1747-1753.

[8]PALACIOSJA,HERRANZ D,DE BONISM L，et al.SIRT1 contributes to telomere maintenance and augments global ho mologous recombination[J].JCell Biol,2010,191(7):1299-1313.

[9]SASAKIT,MAIERB,BARTKEA，et al.Progressive loss of SIRT1 with cell cycle withdrawal[J].Aging Cell,2006，5(5):413-422.

[10]HOMMA K,SONEM,TAURA D,et al.sirt1 plays an important rolein mediating greater functionality of human ES/iPS-derived vascular endothelial cells[J].Atherosclerosis,2010,212(1):42-47.