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夏枯草中熊果酸含量的UPLC测定

2014-11-18谢文剑曹艺柏玉冰等

中国当代医药 2014年28期
关键词:夏枯草含量测定

谢文剑+曹艺+柏玉冰等

[摘要] 目的 建立夏枯草药材中熊果酸含量的超高效液相色谱法(UPLC)测定方法。 方法 采用UPLC进行测定,色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),以甲醇-0.5%冰乙酸水为流动相进行等度洗脱,流速为0.3 ml/min,柱温30℃,检测波长210 nm。 结果 熊果酸在0.2461~0.4922 mg范围内呈良好的线性关系(r2=0.9999),平均回收率为99.29%,RSD=1.74%,熊果酸在夏枯草中的含量为0.28%~0.53%。 结论 该方法快速、高效、重现性好,可以为夏枯草药材的质量控制提供更有效的手段。

[关键词] 夏枯草;熊果酸;超高效液相色谱法;含量测定

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2014)10(a)-0011-03

夏枯草为唇形科植物夏枯草(Prunella vulgaris L.)的干燥成熟果穗,味辛、苦,性寒,具有清肝泻火、明目、散结消肿之功效[1]。夏枯草的主要化学成分有三萜、黄酮、甾体、香豆素、蒽醌、苯丙素等[2]。其中的主要成分熊果酸具有镇静、抗溃疡、降低血糖、抗炎、抗菌等多种生物学效应[3-5]。近年来,又发现熊果酸具有抑制癌细胞增长、转移和诱导癌细胞凋亡等作用,极有可能成为一种新型抗癌药物[6-8]。另外,熊果酸还具有明显的抗氧化功能,被广泛用作医药和化妆品原料[9]。

目前关于夏枯草药材的质量控制研究主要是以熊果酸、齐墩果酸和迷迭香酸等的HPLC含量测定和夏枯草药材的HPLC指纹图谱为主[10-14],关于夏枯草超高效液相色谱法(UPLC)含量测定的研究还未有报道,且相比于传统的HPLC而言,UPLC具有柱效高、分离度好和分离快等优点,大大缩短了样品运行的时间,可以满足当下高通量分析的要求。因此,本实验采用UPLC建立夏枯草药材中熊果酸含量测定方法[15],测定不同批次的夏枯草药材中熊果酸的含量,该方法灵敏度高,分离度好,重现性好,可以为夏枯草药材的质量控制提供更有效的手段。

1 实验材料

1.1 仪器

SK3300H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司),T-214型电子分析天平(Denver公司),Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱系统、Empower工作站、四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器(Waters 公司)。

1.2 试剂

甲醇(色谱纯,Sigma公司),冰乙酸(色谱纯,天津市化学试剂研究所),水为怡宝纯净水。对照品熊果酸为本课题组自制,纯度>98%。

1.3 材料

15份夏枯草样品均由广州白云山星群(药业)股份有限公司提供,经中药鉴定教研室龚力民老师鉴定为唇形科植物夏枯草。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),以甲醇-0.5%冰乙酸水(80∶20)为流动相系统进行等度洗脱,检测波长为210 nm,流速0.3 ml/min,柱温30℃,进样量1 μl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取熊果酸对照品10.70 mg,置于10 ml容量瓶中,加甲醇10 ml定容至刻度,密塞,摇匀,即得(每毫升对照品溶液含熊果酸1.07 mg)。

2.3 供试品溶液的制备

称取夏枯草粉末约1.0 g,精密称定,置于100 ml具塞锥形瓶中,加入甲醇10 ml,密塞超声30 min,放冷至室温,用甲醇补足重量,摇匀,0.22 μl微孔滤膜滤过,即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取对照品溶液0.2、0.25、0.35、0.4、0.5 ml,分别置于1 ml容量瓶中,用甲醇定容,摇匀。分别取对照品溶液1 μl注入UPLC色谱仪,按上述色谱条件测定熊果酸峰面积积分值,以对照品峰面积积分值为纵坐标,对照品含量为横坐标绘制标准曲线。计算熊果酸的回归方程:Y=1.10×106X+6.93×104(r2=0.9997),线性范围0.2461~0.4922 mg。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度实验 取同一对照品溶液,重复进样6次,进样体积1 μl,按上述色谱条件测定熊果酸峰面积积分值,计算峰面积的RSD=1.47%,表明本方法精密度良好,符合方法学考察要求。

2.5.2 稳定性试验 取同一对照品溶液,分别在0、2、4、8、12、24 h进样,进样体积1 μl,按上述色谱条件测定熊果酸峰面积积分值,计算24 h内峰面积的RSD=1.62%,表明熊果酸在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取同一批夏枯草样品6份,每份约1.0 g,精密称定,按上述供试品溶液的制备方法制备。取1 μl注入UPLC色谱仪,在上述色谱条件下测定熊果酸峰面积积分值,计算熊果酸峰面积的RSD=1.54%,表明熊果酸重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验 取已知熊果酸含量的夏枯草粉末6份,每份约0.5 g,精密称定,分别加入熊果酸对照品适量,按上述供试品溶液制备方法制备。分别取样品供试液1 μl注入UPLC色谱仪,测定熊果酸峰面积积分值,计算平均回收率为99.29%,RSD=1.74%,表明本方法加样回收率良好(表1)。

2.6 含量测定

取不同批次的夏枯草样品,每份约1.0 g,精密称定,按上述供试品溶液制备方法制备。分别取样品供试液1 μl注入UPLC色谱仪,测定熊果酸峰面积积分值,计算15份供试品溶液中熊果酸的含量(表2),对照品及样品色谱图见图1。

3 讨论

本实验考察了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6种不同提取溶剂,基于熊果酸峰面积确定了甲醇为提取溶剂。分别考察了10、15、20、25、30 ml五个体积,结果表明,提取溶剂体积为15 ml时,提取夏枯草样品中熊果酸的效率最佳。比较超声与回流两种提取方法,超声提取的效率要高于回流提取的提取率,故选择超声提取。分别考察不同超声时间15、30、45、60 min,确定超声时间为45 min。

对夏枯草中化学成分研究表明,其所含的三萜酸类成分主要为熊果酸和齐墩果酸。两者为同分异构体,结构极为相似,仅在C19和C20上有一个甲基位置的差异,给分离带来一定难度,且熊果酸、齐墩果酸中无共轭体系,紫外吸收波长较短。在210 nm处,熊果酸的吸收峰灵敏度较高,其他色谱峰的干扰较小,分离最为理想,故选择检测波长为210 nm,测定熊果酸的含量。

不同产地夏枯草中熊果酸的含量存在的差别较大,这可能是由于不同采集地点生长环境的不同,药材的生长年限、采收季节、原产地加工也均存在差异。因此,应注意有效成分含量的差别,严格规定夏枯草药材的生长期、采收期,以保证临床用药的安全有效性。

本研究所建立的夏枯草中有效成分熊果酸的含量测定方法快速、准确,与传统的HPLC测定方法相比,样品的运行时间大大缩短,峰形与分离度均较好。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中国药典2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010:263.

[2] 王祝举,赵玉英,涂光忠,等.夏枯草化学成分的研究[J].药学学报,1999,34(9):679-681.

[3] Liu J.Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid[J].J Ethnopharmacol,1995,49(2):57-68.

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[8] Zang L,Wu B,Lin Y,et al.Research progress of ursolic acid′s anti-tumor actions[J].Chin J Integr Med,2014,20(4):72-79.

[9] Santiago LA,Dayrit KC,Correa PCB,et al.Comparison of antioxidant and free radical scavenging activity of triterpenes α-amyrin,oleanolic acid and ursolic acid[J].J Nat Prod,2014.[Epub ahead of print]

[10] 许招懂,姚江雄,刘菊妍,等.夏枯草药材 HPLC 指纹图谱研究[J].中药材,2012,35(8):1234-1237.

[11] 秦雯,巴寅颖,张兰珍,等.不同产地夏枯草药材HPLC特征图谱[J].中华中医药杂志,2012,27(5):1418-1420.

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[13] 刘伟,丁海杰.HPLC测定夏枯草中熊果酸,齐墩果酸,迷迭香酸的含量[J].中成药,2008,30(4):577-580.

[14] 方罗,林能明,吴永江.高效液相色谱同时测定夏枯草药材中4种活性成分的含量[J].中国中药杂志,2010, 35(5):616-619.

[15] 沈盼盼,谢晓梅,张圣龙,等.UPLC法测定宣木瓜中齐墩果酸、熊果酸[J].南京中医药大学学报,2013,29(3):271-273.

(收稿日期:2014-07-11 本文编辑:林利利)

3 讨论

本实验考察了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6种不同提取溶剂,基于熊果酸峰面积确定了甲醇为提取溶剂。分别考察了10、15、20、25、30 ml五个体积,结果表明,提取溶剂体积为15 ml时,提取夏枯草样品中熊果酸的效率最佳。比较超声与回流两种提取方法,超声提取的效率要高于回流提取的提取率,故选择超声提取。分别考察不同超声时间15、30、45、60 min,确定超声时间为45 min。

对夏枯草中化学成分研究表明,其所含的三萜酸类成分主要为熊果酸和齐墩果酸。两者为同分异构体,结构极为相似,仅在C19和C20上有一个甲基位置的差异,给分离带来一定难度,且熊果酸、齐墩果酸中无共轭体系,紫外吸收波长较短。在210 nm处,熊果酸的吸收峰灵敏度较高,其他色谱峰的干扰较小,分离最为理想,故选择检测波长为210 nm,测定熊果酸的含量。

不同产地夏枯草中熊果酸的含量存在的差别较大,这可能是由于不同采集地点生长环境的不同,药材的生长年限、采收季节、原产地加工也均存在差异。因此,应注意有效成分含量的差别,严格规定夏枯草药材的生长期、采收期,以保证临床用药的安全有效性。

本研究所建立的夏枯草中有效成分熊果酸的含量测定方法快速、准确,与传统的HPLC测定方法相比,样品的运行时间大大缩短,峰形与分离度均较好。

[参考文献]

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[10] 许招懂,姚江雄,刘菊妍,等.夏枯草药材 HPLC 指纹图谱研究[J].中药材,2012,35(8):1234-1237.

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[12] 孙乙铭,徐建中,王志安,等.高效液相色谱法测定不同产地的夏枯草中熊果酸含量[J].时珍国医国药,2009,20(5):1125-1126.

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[14] 方罗,林能明,吴永江.高效液相色谱同时测定夏枯草药材中4种活性成分的含量[J].中国中药杂志,2010, 35(5):616-619.

[15] 沈盼盼,谢晓梅,张圣龙,等.UPLC法测定宣木瓜中齐墩果酸、熊果酸[J].南京中医药大学学报,2013,29(3):271-273.

(收稿日期:2014-07-11 本文编辑:林利利)

3 讨论

本实验考察了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6种不同提取溶剂,基于熊果酸峰面积确定了甲醇为提取溶剂。分别考察了10、15、20、25、30 ml五个体积,结果表明,提取溶剂体积为15 ml时,提取夏枯草样品中熊果酸的效率最佳。比较超声与回流两种提取方法,超声提取的效率要高于回流提取的提取率,故选择超声提取。分别考察不同超声时间15、30、45、60 min,确定超声时间为45 min。

对夏枯草中化学成分研究表明,其所含的三萜酸类成分主要为熊果酸和齐墩果酸。两者为同分异构体,结构极为相似,仅在C19和C20上有一个甲基位置的差异,给分离带来一定难度,且熊果酸、齐墩果酸中无共轭体系,紫外吸收波长较短。在210 nm处,熊果酸的吸收峰灵敏度较高,其他色谱峰的干扰较小,分离最为理想,故选择检测波长为210 nm,测定熊果酸的含量。

不同产地夏枯草中熊果酸的含量存在的差别较大,这可能是由于不同采集地点生长环境的不同,药材的生长年限、采收季节、原产地加工也均存在差异。因此,应注意有效成分含量的差别,严格规定夏枯草药材的生长期、采收期,以保证临床用药的安全有效性。

本研究所建立的夏枯草中有效成分熊果酸的含量测定方法快速、准确,与传统的HPLC测定方法相比,样品的运行时间大大缩短,峰形与分离度均较好。

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[5] Nascimento PGG,Lemos TLG,Bizerra A,et al.Antibacterial and antioxidant activities of ursolic acid and derivatives[J].Molecules,2014,19(1):1317-1327.

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[8] Zang L,Wu B,Lin Y,et al.Research progress of ursolic acid′s anti-tumor actions[J].Chin J Integr Med,2014,20(4):72-79.

[9] Santiago LA,Dayrit KC,Correa PCB,et al.Comparison of antioxidant and free radical scavenging activity of triterpenes α-amyrin,oleanolic acid and ursolic acid[J].J Nat Prod,2014.[Epub ahead of print]

[10] 许招懂,姚江雄,刘菊妍,等.夏枯草药材 HPLC 指纹图谱研究[J].中药材,2012,35(8):1234-1237.

[11] 秦雯,巴寅颖,张兰珍,等.不同产地夏枯草药材HPLC特征图谱[J].中华中医药杂志,2012,27(5):1418-1420.

[12] 孙乙铭,徐建中,王志安,等.高效液相色谱法测定不同产地的夏枯草中熊果酸含量[J].时珍国医国药,2009,20(5):1125-1126.

[13] 刘伟,丁海杰.HPLC测定夏枯草中熊果酸,齐墩果酸,迷迭香酸的含量[J].中成药,2008,30(4):577-580.

[14] 方罗,林能明,吴永江.高效液相色谱同时测定夏枯草药材中4种活性成分的含量[J].中国中药杂志,2010, 35(5):616-619.

[15] 沈盼盼,谢晓梅,张圣龙,等.UPLC法测定宣木瓜中齐墩果酸、熊果酸[J].南京中医药大学学报,2013,29(3):271-273.

(收稿日期:2014-07-11 本文编辑:林利利)

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